中醫(yī)證候上火與生物標志物之間的相關(guān)性

周嚴嚴 趙海譽 王宏潔 司南 王彥禮 楊健 邊寶林

中國中醫(yī)科學院中藥研究所 北京 100700

上火是臨床上常見的一種病癥，包括口腔潰瘍、牙齦腫痛、口燥咽干、鼻衄、目赤，并可伴有小便短赤、大便干結(jié)等癥[1-2]。上火的原因與食物、勞累、環(huán)境等密切相關(guān)[3-6]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為“上火”發(fā)病機制為中分子物質(zhì)過多、下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)功能偏低、腸道微生態(tài)失衡導致腸道處炎癥狀態(tài)[7-10]?！吧匣稹迸c菌群失調(diào)具有相關(guān)性，菌群結(jié)構(gòu)及功能失調(diào)，可誘導氧化應激，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性下降，促炎因子分泌增多，同時導致脂質(zhì)代謝紊亂，從而引發(fā)局部炎癥反應的發(fā)生[11]。從“上火”到形成疾病是一種包括中樞、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的應激負荷反應過程[11-12]，可見“上火“與炎癥因子、氧化應激、能量代謝和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，同時也與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和菌群有關(guān)。

1 “上火”促進炎癥因子的釋放與合成

從病癥表現(xiàn)上，上火與發(fā)炎有著一樣的癥狀，均表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛的現(xiàn)象，如牙齦疼痛、咽喉干痛、口舌生瘡、口渴口苦、大便干結(jié)等癥狀?！吧匣稹被颊叩囊恍┡R床表現(xiàn)是由于抗炎與抑炎的平衡被破壞[13]。炎癥發(fā)生時，致炎因子對自身組織攻擊導致體內(nèi)免疫系統(tǒng)紊亂，導致生理機能失調(diào)而致機體病變。有研究者認為防治上火應保障機體平衡，提高免疫力，而炎癥的發(fā)生也與免疫力有著密切關(guān)系[13-14]。“上火”屬于中醫(yī)“熱證”范疇，實熱證以免疫亢進為主，虛熱證以免疫功能降低為主，兩者都存在T細胞免疫功能紊亂。其中Th3主要在黏膜組織中誘導生成，并通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)和少量的白細胞介素-4（interleukin-4,IL-4）、白細胞介素-10（interleukin-10,IL-10）促進分泌性免疫球蛋白 A（secretory immunoglobulin A,sIgA）分泌，增強黏膜免疫力[11]。牙齦炎的發(fā)生和菌斑內(nèi)的細菌積聚有密切關(guān)系，尤其是革蘭陰性厭氧菌的內(nèi)毒素刺激單核細胞、成纖維細胞等分泌腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis Factor-α,TNF-α）、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）等多種炎癥介質(zhì)。而內(nèi)毒素在體內(nèi)通過對細胞的直接毒害作用、介導炎癥反應和免疫應答三種途徑，來對牙周組織造成一定的破壞[15-19]。其中IL-1β起關(guān)鍵作用，牙齦組織中IL-1β的含量與炎性細胞浸潤的程度和牙齦炎的臨床嚴重程度呈正相關(guān)[20-23]。說明上火與 IL-1β、TGF-β、IL-4、IL-10、TNF-α、IL-6、MCP-1等炎癥因子的釋放與合成有關(guān)。

汪琴靜等[24]通過對“上火”人群中細胞因子激活素A（activin,A）及E選擇素（E-selectin）血清含量的測定以及外周血單個核細胞基因表達水平檢測，發(fā)現(xiàn)“上火”患者血清中以及外周血單個核細胞activin A、E-selectin基因表達水平均高于正常人群，說明“上火”是一種局部的炎癥反應，誘導炎性反應影響機體生理平衡，這是“上火”機制之一。另外，采用i－TRAQ-2DLCMS/MS蛋白組學技術(shù)與生物信息學手段分析，知柏地黃丸可通過調(diào)節(jié)大鼠血清凝溶膠蛋白(gelsolin,Gsn)、纖溶酶原(plasminogen,Plg)、纖維蛋白原 α 鏈（Fibrinogen α chain,Fga）、胸腺素 β4（thymosin β4,Tmsβ4）和膠原蛋白 α2-I型鏈（collagenα2-I chain,Col1a2）的水平清除損傷組織，抑制細胞凋亡作用。同時可降低促炎炎癥因子的分泌，促進炎性反應損傷愈合的作用[25]。

2 “上火”引起氧化應激反應

情志刺激、辛辣食物、勞累過度等因素導致機體內(nèi)環(huán)境變化，過量的氧自由基誘導氧化應激反應，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物明顯增多，其中4-羥基壬烯酸（4-hydroxynonenal,4-HNE）通過顯著抑制細胞AMPK磷酸化水平，誘導細胞損傷。運用中藥系統(tǒng)藥理學來分析黃連解毒湯，進而研究“上火”與氧化應激之間的關(guān)系，結(jié)果表明“上火”與氧化應激或者自由基增多密切相關(guān)[26]。觀察臨床實熱“上火”組血漿中丙二醛（malonaldehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）濃度水平均高于對照組，而白細胞內(nèi)的活性氧（reactive oxtgen species,ROS）含量顯著下降，提示實熱“上火”與氧化應激關(guān)系密切[27]。

“上火”狀態(tài)會激活細胞內(nèi)的NO合酶基因的表達產(chǎn)生大量NO，NO在超氧陰離子的作用下大量轉(zhuǎn)化成毒性更強的過氧硝酸根離子，其破壞呼吸鏈復合酶導致ROS大量的產(chǎn)生。同時使ROS消除通路中的關(guān)鍵酶SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)活性異常，大量 ROS轉(zhuǎn)化成毒性很強的羥自由基，羥自由基造成DNA斷裂、蛋白質(zhì)變性及脂質(zhì)過氧化。最終使得細胞MDA含量升高，氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity,ORAC）下降，使機體功能下降(圖1)[25]，表明維持體內(nèi)的自由基和抗氧化防御系統(tǒng)的平衡可有效緩解“上火”的癥狀。另外，有研究通過蛋白質(zhì)組學篩選實熱“上火”血清差異表達蛋白，載脂蛋白C3(apolipoprotein C3,ApoC3)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和維生素K依賴蛋白S(vitamin K-dependent protein S,PROS1)等顯著上調(diào)，而載脂蛋白A4(apo-lipoprotein A4,Apo A4)、超氧化物歧化酶3(superoxide dismutase 3,SOD3)和纖溶酶原激活物抑制劑1(plasmino－gen activator inhibitor 1,PAI-1)等顯著下調(diào)，其中細胞外SOD3具有抗血管生成和抗炎作用。當組織細胞受到炎性反應等損傷時，LDH會釋放到細胞外，血中含量相應增加。結(jié)合代謝組學結(jié)果乳酸含量在“上火”人群中升高，表明實熱“上火”情況下糖酵解增強[28]。張方博等[29]研究表明上火牙齦炎時，大鼠飲水量和尿量減少，總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)和過氧化氫酶 (hydrogen peroxidase catalase,CAT)表達水平降低。黃連解毒湯作為清熱解毒的經(jīng)典代表方，祛除“上火”的復方，能增加大鼠飲水量和尿量，升高 T-SOD和CAT的表達水平。說明黃連解毒湯可通過抑制氧化應激緩解上火牙齦炎癥狀。綜上表明改善氧化應激因子可緩解上火癥狀，如 ROS、4-HNE、LDH、GPX、SOD3、MDA 等。

3 “上火”引起能量和脂代謝失常

上火作為一種火熱病癥，其與寒證的最直觀的區(qū)別主要在于能量代謝的高低。AMPK是調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵因子，而能量代謝又與炎癥密切相關(guān)[30]，由于生理過程需要能量去維持腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟及肌肉等的組織功能，而機體的能量來源主要通過飲食中的葡萄糖和脂質(zhì)提供，應激會直接影響體內(nèi)的糖代謝及脂代謝過程，因而體內(nèi)糖代謝及脂代謝低下也被認為是“上火”引起身心疲勞的一個原因。

圖1 應激負荷造成機體氧化損傷的機制示意圖Fig.1 Schematic diagram of mechanism of oxidative damage caused by stress load

能量代謝紊亂可引起黏膜損傷，使黏膜免疫系統(tǒng)中 Th17/Treg細胞比例上調(diào)，sIgA分泌減少，局部黏膜免疫力下降，可能進一步感染進而引起黏膜損傷。因此，頭面部黏膜上皮組織的生理特點決定了其是上火的易發(fā)部位。與健康對照組相比，患有重度牙齦炎的患者體內(nèi)短鏈羧酸的含量大于10倍。若用短鏈羧酸刺激健康人群，能夠促進牙齦炎癥反應的發(fā)生，同時也能促進促炎因子的釋放與合成。而短鏈羧酸又能激活AMPK，說明牙齦炎與AMPK和炎癥有密切關(guān)系[31-32]。

丙酮酸是糖酵解過程中的產(chǎn)物，正常情況下通過三羧循環(huán)氧化成CO2和H2O。血中乳酸/丙酮酸的比值正常維持在9左右。當機體缺氧時，丙酮酸被還原為乳酸，該比值上升。有研究采用GC-MS技術(shù)對實熱上火后血清代謝物的特異性變化進行分析，與正常對照組比較，實熱上火人群血清中乳酸、油酸、亞油酸、甘油、酪氨酸和三羧酸循環(huán)中間物（檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸）等表達顯著上調(diào)，而絲氨酸、蘇氨酸、4-羥基脯氨酸等顯著下調(diào)，表明實熱上火人群體內(nèi)能量代謝處于旺盛的狀態(tài)且局部有炎性反應，如潰瘍、咽炎、牙齦炎等[33]。炎性反應部位物質(zhì)分解代謝加快，組織耗氧量增加，引起無氧糖酵解增強，釋放的乳酸未能及時被清除，發(fā)生堆積，導致患者血中乳酸出現(xiàn)上調(diào)[27]。這些研究說明實熱上火人群中能量代謝相關(guān)的變化主要集中在糖酵解、三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝三個方面（圖 2）。

上火牙齦炎時果糖二磷酸醛縮酶C、磷酸甘油醛異構(gòu)酶1和結(jié)節(jié)性硬化綜合征2型(Tuberous sclerosis complex-2,TSC2)均表達升高，黃連解毒湯可通過降低果糖二磷酸醛縮酶C和磷酸甘油醛異構(gòu)酶1的表達，抑制能量代謝相關(guān)通路分子TSC2的表達，發(fā)揮治療上火牙齦炎的作用[29]。

4 “上火”會引起神經(jīng)-內(nèi)分泌功能紊亂

從“上火”到形成疾病是一種包括中樞、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的應激負荷反應過程，應激負荷涉及到中樞皮層及邊緣系統(tǒng)和下丘腦一垂體一腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)的神經(jīng)遞質(zhì)、激素、基因表達等多層次，可以部分反應心理的應激狀態(tài)[34]。HPA與中醫(yī)理論中的“腎-天癸-沖任-胞宮”具有相似功能。虛熱證時，垂體-甲狀腺機能活躍，去甲腎上腺素（noradrenaline,NE）、腎上腺素（epinephrine,E）、兒茶酚胺（catecholamines,CA）等含量增高，紅細胞上乙酰膽堿酯酶活性增高，實熱證早期，交感神經(jīng)和垂體-腎上腺系統(tǒng)機能增強，皮質(zhì)素增多，5-羥色胺(serotonin,5-HT)降低，結(jié)果說明無論虛熱證還是實熱證均能引起神經(jīng)-內(nèi)分泌功能紊亂[35]。何蓉蓉[36]研究發(fā)現(xiàn)廣東涼茶在抗應激作用時，應激負荷大鼠模型的大腦皮質(zhì)、海馬和血漿中5-HT和5-吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)含量顯著低于正常對照組，說明涼茶對“上火”模型大鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)具有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖2 糖酵解、三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝相互關(guān)系示意圖Fig.2 Schematic diagram of the relationship between glycolysis,tricarboxylic acid cycle and lipid metabolism

5 “上火”的發(fā)生同菌群改變密切相關(guān)

“上火”者表現(xiàn)有能量代謝紊亂及粘膜免疫失調(diào)。菌群多方面參與機體的能量產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化、儲存和利用，并通過改變組織對能量的利用方式、改變 AMPK磷酸化等途徑來影響機體的能量代謝，因而菌群微生態(tài)失衡可導致能量代謝發(fā)生失調(diào)。腸粘膜免疫功能下降會使腸道處于炎癥狀態(tài)，造成腸道微生態(tài)平衡紊亂[14]。與腸道菌群類似，口腔中細胞炎癥因子(如金屬蛋白酶、一氧化氮合成酶、前列腺素E2、干擾素－γ)與牙周軟硬組織炎癥程度呈正相關(guān)關(guān)系，當患者食用益生菌如含乳酸桿菌的食物后，體內(nèi)細胞炎癥因子水平顯著降低。因此口腔菌群微生態(tài)與炎癥密切相關(guān)[37-38]?？谇晃⑸鷳B(tài)研究已經(jīng)成為研究熱點，有研究表明牙周炎患者的唾液中也發(fā)現(xiàn)生物標志物，其中血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide,VIP）和神經(jīng)肽 Y（neuropeptide Y,NPY）在唾液中的水平高于血清水平，因此唾液中VIP和NPY可能是牙齦炎或牙周炎唾液中的潛在差異生物標志物[37]。與正常牙齦組織相比，牙齦炎組織的纖溶酶原激活劑活性顯著提高，齦溝液和未刺激唾液中的溶菌酶活性與牙齦炎或牙周炎患者的牙周袋深度相關(guān)。牙周炎組齦下菌斑樣本中的消化鏈球菌、牙結(jié)核桿菌和直腸彎曲菌占優(yōu)勢。而牙齦炎中纏結(jié)優(yōu)桿菌和侵蝕艾肯菌占優(yōu)勢[39-41]。

除此之外，王召平[42]對體檢人群中的261例上火者及121例非上火者的體檢數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯示上火組的體重指數(shù)（body mass index,BMI）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、血尿酸（blood uric acid,BUA）高于對照組，高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、尿比重（specific gravity of urine,SG）顯著低于對照組，說明體內(nèi)的代謝廢物蓄積可能是“上火”的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，腎臟的排泄功能對清除“上火”具有重要意義，并推測尿樣中可能存在與上火有關(guān)的生物標志物，需要進一步的探討研究。

6 結(jié)語

綜上所述，上火是在精神緊張、過度勞累、飲食刺激、口腔或腸道微生物感染等因素綜合作用下，人體內(nèi)環(huán)境發(fā)生以炎癥免疫、氧化應激、能量代謝和脂質(zhì)代謝為主的變化，同時伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)變化和菌群的失調(diào)，主要表現(xiàn)為頭面部皮膚黏膜發(fā)生紅腫熱痛等炎癥反應?？梢娚匣鹗且浴把装Y因子-氧化應激因子-能量相關(guān)因子”為主要指標，并且這些指標受中樞神經(jīng)和菌群的影響。當然，這些指標需通過臨床試驗進一步驗證，為下一步找到臨床可檢測的生物標志物奠定基礎(chǔ)。