香附四物湯中阿魏酸和芍藥苷的大鼠腸吸收動力學(xué)研究

畢肖林， 朱海燕， 劉陶世， 馬世堂

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.安徽科技學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

中藥多以口服途徑給藥,中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的重要形式和手段。通過研究藥物在體內(nèi)的吸收動力學(xué)過程,明確其在體內(nèi)的作用途徑和機(jī)制,有助于闡明中藥的科學(xué)內(nèi)涵,從而指導(dǎo)臨床合理用藥。

單向灌流法,即對某一腸段進(jìn)行灌流,根據(jù)腸段進(jìn)出口處灌流液中藥物的濃度差來考察藥物在該腸段的吸收情況。大鼠在體腸灌流是目前運(yùn)用最廣泛的研究腸吸收的方法,因其試驗(yàn)條件與藥物在口服給藥后接觸到的腸道環(huán)境近似[1-2],能較實(shí)際地反映藥物的腸道吸收情況。

香附四物湯出自清代梁廉夫《不知醫(yī)必要》卷四,由當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地、木香、香附、延胡索等七味藥組成,是治療婦科氣滯血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的代表性方劑[3]。本試驗(yàn)通過建立大鼠的在體腸吸收模型,對香附四物湯中的活性成分阿魏酸及芍藥苷在體內(nèi)的吸收規(guī)律進(jìn)行考察,有助于我們了解香附四物湯這類復(fù)方制劑在胃腸道內(nèi)的吸收特性,為中藥劑型的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(美國Waters有限公司)、蠕動泵(BT00-300M,保定蘭格恒流泵有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠)、微量高速冷凍離心機(jī)(Thermo Micro 21R,美國Thermo科技有限公司)、T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)、十萬分之一天平(New Classic MS,METTLER TOLEDO公司)、超純水機(jī)(Direct-Q5 UV系統(tǒng),美國Millipore有限公司)。

1.2 試驗(yàn)材料

阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,含量99.6%,批號:110773-201313)、芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,含量96.4%,批號:110736-201438);酚紅(天津市化學(xué)試劑研究院);當(dāng)歸、熟地黃、川芎、炒白芍、延胡索、醋香附、木香(安徽省萬生中藥飲片有限公司);甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)動物

雄性SD大鼠,體重(250±30) g,由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供,合格證號:SCXK(滬)2013-0006。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 香附四物湯水煎液的制備 稱取香附四物湯組方藥材,按照當(dāng)歸∶熟地∶川芎∶白芍∶延胡索∶香附∶木香=3∶4∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1配比,經(jīng)粉碎至粒徑可過40目篩,純水煎煮提取2次,第1次加10倍量純水煎煮2 h,第2次加8倍量純水煎煮2 h,合并2次煎出液,濃縮至1 g/mL,作為香附四物湯水煎劑供試樣品[4]。

1.4.2 溶液的配制

1.4.2.1 對照品溶液的配制 分別精密稱定阿魏酸、芍藥苷對照品10.12、10.50 mg,加甲醇超聲溶解,定容于10 mL容量瓶中,分別得質(zhì)量濃度為1.012、1.026 mg/mL的對照品母液;分別吸取各對照品母液,加適量甲醇稀釋至10 mL,得質(zhì)量濃度為0.101 2、0.525 mg/mL的混合對照品溶液,4 ℃放置備用。

1.4.2.2 Krebs-Ringer腸營養(yǎng)液配制 稱氯化鈉7.8 g,葡萄糖1.4 g,碳酸氫鈉1.37 g,氯化鉀0.35 g,磷酸二氫鈉0.32 g,氯化鎂0.02 g,溶解于適量純水中,并加純水稀釋至1 000 mL,超聲混勻[5]。

1.4.2.3 酚紅液的配制 稱取酚紅20 mg溶于1 000 mL的Krebs-Ringer腸營養(yǎng)液中,混勻即得[6]。

1.4.2.4 腸灌流液的配制 吸取一定的香附四物湯水提液與定量的酚紅液混合,密閉,并攪拌10 min,制得低、中、高3個(gè)不同濃度的香附四物湯腸灌流液。

1.4.2.5 空白腸灌流液 取K-R灌流液適量,按“1.4.5”節(jié)試驗(yàn)方法灌流,收集流出液,即得空白腸灌流液[7]。

1.4.3 色譜條件 色譜柱:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm);流動相:乙腈-0.1%磷酸(25∶75);柱溫:25 ℃;流速:0.8 mL/min;檢測波長:雙波長320、230 nm;進(jìn)樣量20 μL。

1.4.4 方法學(xué)考察

1.4.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取混合對照品母液0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL,用K-R液稀釋并定容至10 mL容量瓶中,得系列對照品混合溶液,在“1.4.3”節(jié)色譜條件下測定。以對照品峰面積平均值A(chǔ)對濃度C(μg/mL)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4.2 精密度試驗(yàn) 分別配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的阿魏酸及芍藥苷對照品溶液,按“1.4.3”節(jié)下色譜條件進(jìn)樣,1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次,連續(xù)進(jìn)樣5 d,并記錄峰面積,計(jì)算日內(nèi)精密度及日間精密度。

1.4.4.3 回收率試驗(yàn) 取低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度對照品混合溶液,按“1.4.3”節(jié)色譜條件測定5 次,將所得的峰面積帶入回歸方程計(jì)算質(zhì)量濃度,以所得質(zhì)量濃度與實(shí)際質(zhì)量濃度的比值作為方法回收率。

1.4.4.4 專屬性考察 分別對阿魏酸及芍藥苷混合對照品溶液、空白腸灌流液、空白腸灌流液+混合對照品溶液以及在體單向腸灌流樣品按“1.4.3”節(jié)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。

1.4.4.5 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用適量K-R緩沖液分別配制含酚紅10、20、30、40、50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取0.5 mL,加入0.2 mol/L的NaOH溶液4.5 mL,搖勻,在558 nm下測定并記錄其吸光度,繪制酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 大鼠在體單向腸灌流試驗(yàn) 取雄性SD大鼠,試驗(yàn)前禁食18 h(自由飲水),麻醉采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射,麻醉后將大鼠放在加熱燈下,以保持其正常體溫。試驗(yàn)時(shí)在大鼠腹腔剪開一個(gè)大約4 cm左右的口子,將要測量的四個(gè)腸段仔細(xì)找出來,并分別進(jìn)行插管,每段兩根,導(dǎo)管插好后用尼龍?jiān)鷰гo。四個(gè)腸段分別為:十二指腸段為從胃幽門下方1 cm處開始量取約10 cm;空腸段為從胃幽門下方15 cm處開始量取約10 cm;回腸段為從盲腸上方20 cm處開始量取約10 cm;結(jié)腸段為從距盲腸1 cm處開始向上量取約10 cm。插完管后將大鼠小腸部分小心放回腹腔,盡量避免卷曲和扭結(jié),切口用等滲生理鹽水浸潤的紗布覆蓋,并每隔10min用37 ℃左右的等滲生理鹽水噴灑在腹部,以保持小腸部分濕潤。手術(shù)時(shí)須小心謹(jǐn)慎,要注意進(jìn)口管和出口管保持同一高度,以免重力影響下溢流。試驗(yàn)時(shí)取含低、中、高不同濃度藥液的腸灌流液(預(yù)熱至37 ℃)300 mL,先以1.0 mL/min 的流速灌流10 min,再將蠕動泵灌流速度調(diào)為0.2 mL/min并保持,預(yù)平衡30 min后,于30～45、45～60、60～75、75～90 min時(shí)間段收集腸灌流液樣品。試驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠,剪下被考察的腸段,測量其長度(L)和內(nèi)徑(r),計(jì)算藥物吸收速率常數(shù)(Ka)和有效滲透系數(shù)(Peff)。

1.4.6 腸灌流液中酚紅的測定 將收集到的腸灌流液樣品離心,各吸取0.5 mL,分別加入0.2 mol/L的NaOH溶液4.5 mL,以0.2 mol/L NaOH溶液作為空白,測定558 nm下的吸光度,根據(jù)酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酚紅濃度。

1.4.7 腸灌流液中藥物濃度的測定 將收集到的灌流液樣品離心,取上清液,按“1.4.3”節(jié)下色譜條件進(jìn)行分析,計(jì)算相應(yīng)濃度。

1.4.8 阿魏酸、芍藥苷在不同pH值K-R液中的穩(wěn)定性考察 配制含中濃度阿魏酸和芍藥苷的香附四物湯K-R液,采用稀HCl和稀NaOH溶液調(diào)節(jié)K-R緩沖液pH值分別為5.51、6.30、7.55、8.98,置于密閉容器中,于37 ℃水浴中放置,分別于0、3 h取樣,測定阿魏酸和芍藥苷的含量[8]。

1.4.9 數(shù)據(jù)分析 在體腸吸收試驗(yàn)中,腸腔內(nèi)可能有被腸道吸收或者腸管分泌的水分,結(jié)果造成灌流液體積發(fā)生改變,本試驗(yàn)采用酚紅法對灌流液體積進(jìn)行校正。大鼠在體單向腸灌流試驗(yàn)中所測得的出口處的阿魏酸及芍藥苷的濃度用公式(1)校正[9]:

(1)

阿魏酸及芍藥苷的有效滲透系數(shù)(Peff)用公式(2)計(jì)算,吸收速率參數(shù)(Ka)用公式(3)計(jì)算:

(2)

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 阿魏酸、芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 阿魏酸的回歸方程:A=184 421.185 4C-81 112,R2=0.999 7(n=6),表明阿魏酸在1.012～20.24 μg/mL之間線性關(guān)系良好;芍藥苷的回歸方程:A=55 700C-69 526,R2=0.999 7 (n=6),表明芍藥苷在5.25～105 μg/mL之間線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度試驗(yàn) 阿魏酸的日內(nèi)精密度分別為1.22%、0.36%、0.45%,日間精密度為1.78%、0.47%、0.27%;芍藥苷的日內(nèi)精密度分別為1.62%、0.84%、0.42%,日間精密度為1.68%、0.98%、0.66%,表明精密度良好。

2.1.3 回收率試驗(yàn) 阿魏酸的回收率分別為98.4%、99.2%、99.4%,RSD分別為2.86%、1.23%、1.89%;芍藥苷的回收率分別為98.1%、98.5%、99.1%,RSD分別為2.01%、1.78%、2.93%。

2.1.4 專屬性考察 由圖1可知,在此條件下空白腸灌流液對阿魏酸、芍藥苷的測定無干擾,目標(biāo)成分的測定也不受樣品中的其他成分的干擾。

A:空白腸灌流液,B:阿魏酸對照品,C:芍藥苷對照品,D:空白腸灌流液+阿魏酸、芍藥苷混合對照品液,E:阿魏酸腸灌流樣品,F:芍藥苷腸灌流樣品

2.2 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

酚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.186 49C+0.015 78,R2=0.999 6 (n=5),表明酚紅質(zhì)量濃度在10～50 μg/mL之間線性關(guān)系較好。

2.3 阿魏酸、芍藥苷在不同pH值K-R液中的穩(wěn)定性考察

由表1可知,阿魏酸和芍藥苷在pH值不同的K-R液中的穩(wěn)定性良好,因考慮到腸道環(huán)境,故選取pH值7.5左右的K-R緩沖液進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 阿魏酸和芍藥苷在不同pH值K-R液中的穩(wěn)定性考察

2.4 在體單向腸灌流試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，在所研究的質(zhì)量濃度范圍之內(nèi),隨著阿魏酸和芍藥苷質(zhì)量濃度的增加,其在大鼠小腸內(nèi)的吸收情況無明顯變化。低濃度的腸灌流液與高濃度的腸灌流液相比較,阿魏酸和芍藥苷在大鼠各個(gè)腸段的Peff均無顯著性差異(P>0.05),這表明阿魏酸和芍藥苷在大鼠小腸內(nèi)的吸收方式主要是被動轉(zhuǎn)運(yùn),且沒有自身濃度抑制作用。

在同一質(zhì)量濃度下比較其在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的Peff、Ka值,發(fā)現(xiàn)阿魏酸和芍藥苷在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的Peff值、Ka值之間均無顯著性差異(P>0.05),表明阿魏酸和芍藥苷在整個(gè)腸道內(nèi)均有一定的吸收,且無特定的吸收部位(表2)。

表2 不同質(zhì)量濃度香附四物湯在大鼠不同腸段中吸收參數(shù)

3 結(jié)論與討論

藥物在體腸吸收情況國內(nèi)目前多采用在體腸循環(huán)技術(shù)進(jìn)行研究。但是由于腸道能吸收水分,導(dǎo)致供試液體積改變,所以有必要對其進(jìn)行校正[10]。試驗(yàn)中通過在灌流液中加入不被腸吸收的物質(zhì)-酚紅來標(biāo)示灌流液體積的變化,使結(jié)果更為準(zhǔn)確。

腸灌流的流速在一定程度上反應(yīng)了腸道蠕動的情況,研究表明,隨著腸灌流速度的增加,腸道的吸收速率常數(shù)會顯著增加[11-12],且長時(shí)間、高流速的在體腸循環(huán)試驗(yàn)會導(dǎo)致大鼠腸黏膜損傷,通透性增加,給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來較大誤差[13]。有文獻(xiàn)報(bào)道[14],健康人體內(nèi)腸道的蠕動速度約為2 mL/min,而大鼠腸道的直徑約為人體腸道的1/10,因而選擇大鼠腸灌流流速為0.2 mL/min。所以,本試驗(yàn)中建立的在體單向腸灌流模型以較低灌流速(0.2 mL/min)、較短的灌流時(shí)間(≤2 h)進(jìn)行灌流,不僅可以較小程度地?fù)p傷大鼠腸黏膜,而且更接近實(shí)際的人體空腹?fàn)顟B(tài)的情況。

在體腸循環(huán)實(shí)驗(yàn)中,藥物對管壁的非特異性吸附也會產(chǎn)生試驗(yàn)誤差,故試驗(yàn)時(shí)需要對管路和腸管預(yù)平衡一段時(shí)間,使對管壁的吸附達(dá)到飽和,也使機(jī)體適應(yīng)灌流過程[6]。本試驗(yàn)以0.2 mL/min的較低流速灌流30 min使灌流液達(dá)到穩(wěn)態(tài)后,開始收集腸灌流液樣品,從而保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性,減少試驗(yàn)誤差。

當(dāng)某化合物在大鼠腸道內(nèi)的平均Peff值小于0.03×10-4cm/s或大于0.2×10-4cm/s時(shí),可以預(yù)測該化合物在人體內(nèi)分別為吸收差或易吸收[15]。由試驗(yàn)結(jié)果可知,香附四物湯中的活性成分阿魏酸及芍藥苷在體內(nèi)較易吸收,且無特定吸收部位。此外,不同濃度的阿魏酸或芍藥苷在大鼠小腸內(nèi)的Peff值均無明顯差異,表明阿魏酸及芍藥苷在小腸中的吸收無自身濃度抑制作用,推測其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可能是被動轉(zhuǎn)運(yùn)。