HPLC同時(shí)測定半夏瀉心湯中8種成分

汪 健， 朱 陽， 許 恒， 江國榮， 張露蓉*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)蘇州附屬醫(yī)院,江蘇 蘇州 215000；2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

半夏瀉心湯由半夏、黃連、干姜、黨參、黃芩、炙甘草、大棗7味藥材組方而成的經(jīng)方，是辛開苦降法的典范方藥，出自醫(yī)圣張仲景的《傷寒雜病論》。全方具有清除中焦?jié)駸嵊魷?，解除脾氣郁遏，恢?fù)脾胃升清降濁；同時(shí)可甘溫補(bǔ)益脾氣，以助中焦氣化的功效。常用于治療胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙性的消化系統(tǒng)疾病[1]。新近的研究顯示半夏瀉心湯湯劑對胃腸激素具有調(diào)控作用，同時(shí)可以改善胰島素抵抗，臨床應(yīng)用于防治糖尿病前期(Impaired glucose regulation, IGR)及糖尿病(Diabetes, DM)，獲得較好的療效[2]。而且，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也顯示半夏瀉心湯可調(diào)控GLP-1的分泌、增加胰島素水平、降低血糖等，表明其具備改善高血糖的效應(yīng)[3-5]。為了進(jìn)一步研究半夏瀉心湯水煎液防治IGR和糖尿病的效應(yīng)物質(zhì)及其機(jī)理，本文應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)建立了同時(shí)測定半夏瀉心湯中8個(gè)主要效應(yīng)成分含量的檢測方法，為半夏瀉心湯水煎液的質(zhì)量控制提供標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法，也為進(jìn)一步的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器于試藥

1.1.1 儀器 Agilent 1260液相色譜系統(tǒng)(Agilent 1260 四元泵，DAD二極管陣列檢測器，全自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent 1260液相色譜工作站)；PL203電子天平(Mettler-Toledo公司)；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Heizbad HB digit玻璃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)。

1.1.2 試劑 對照品蘆丁(批號：16113006)、黃芩苷(批號：041202)、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(批號：16080301)、漢黃芩苷(批號：17010904)、黃芩素(批號：17012802)、鹽酸藥根堿(批號：17031002)、大黃素(批號：110756-200110)、漢黃芩素(批號：17012304)，均購自于上海純優(yōu)生科技有限公司，色譜純。水，高純水；乙腈，色譜純(西班牙SCHARLAB S.L)；甲醇，色譜純(無錫市展望化工試劑有限公司)。試驗(yàn)用水為去離子水。

1.1.3 藥材 法半夏(批號產(chǎn)地：160430四川)、干姜(批號產(chǎn)地：160506四川)、黃芩(批號產(chǎn)地：160604河北)、黃連(批號產(chǎn)地：160306四川)、黨參(批號產(chǎn)地：160321甘肅)、炙甘草(批號產(chǎn)地：160223內(nèi)蒙古)和大棗(批號產(chǎn)地：160309江蘇)七味藥材均購自于蘇州市春輝堂藥業(yè)有限公司。經(jīng)蘇州市中醫(yī)醫(yī)院研究院江國榮主任鑒定：法半夏為天南星科植物半夏干燥塊莖的炮制加工品；干姜為姜科植物干姜的干燥根莖；黃芩干姜為唇形科植物黃芩的干燥根；黃連為毛莨科植物黃連的干燥根莖；黨參為桔梗科植物黨參的干燥根；甘草為豆科植物甘草干燥根及根莖的炮制加工品；大棗為鼠李科植物棗的干燥成熟果實(shí)。

半夏瀉心湯水煎液的制備：按照《傷寒雜病論》中的配比(法半夏15 g、黃連3 g，黃芩9 g，炙甘草9 g，干姜9 g，黨參9 g，大棗4枚)進(jìn)行稱量，加8倍量冷水浸潤30 min，回流提取40 min，趁熱過濾上清液。藥渣中再加6倍量水，回流提取30 min，趁熱過濾上清液。合并兩次得到的上清液，減壓濃縮至1 g/mL流浸膏冷藏備用。共制備10批次，批號分別為：170509、170510、170511、170512、170513、170514、170515、170516、170517、170518。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、鹽酸藥根堿、漢黃芩素、大黃素對照品各1.90、1.98、2.10、2.05、2.16、2.00、0.56、1.96 mg，用甲醇定容至1 mL，即得混合對照品儲備液，置于4 ℃冰箱保存。取對照品儲備液，用甲醇稀釋配制成每1 mL分別含蘆丁30.182 μg、黃芩苷45.987 μg、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷56.662 μg、漢黃芩苷61.520 μg、黃芩素69.300 μg、鹽酸藥根堿35.100 μg、大黃素1.620 μg、漢黃芩素44.100 μg的混合對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密量取制備的半夏瀉心湯水煎液的濃縮液1 mL，與同體積的甲醇混勻，于12 000 rpm離心10 min，吸取上清液，再重復(fù)離心一次，得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Extend-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(B液)和0.05%三乙胺水溶液(pH 2.1)(A液)如表1所示的梯度條件進(jìn)行洗脫；流速為1 mL/min ；檢測波長為280 nm；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

表1 乙腈-水梯度洗脫表

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察

在1.2.3節(jié)下，蘆丁、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、鹽酸藥根堿、大黃素、漢黃芩素的保留時(shí)間分別約為33.5、42.1、54.7、67.6、72.6、85.9、96.6、106.7 min，其它成分對測定無干擾(圖1～2)。

圖1 供試品

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品

2.2 線性關(guān)系考察

取不同濃度的混合對照品，分別以各個(gè)成分的對照品質(zhì)量濃度(X)作為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程(表2)。

表2 各成分的線性關(guān)系

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液，按“1.2.3節(jié)方法連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL。記錄8個(gè)成分的保留時(shí)間和峰面積，并分別計(jì)算RSD。結(jié)果蘆丁、黃芩苷、千層紙素、漢黃芩苷、黃芩素、鹽酸藥根堿、大黃素、漢黃芩素保留時(shí)間的RSD分別為0.95%、0.81%、4.60%、4.18%、2.18%、0.81%、0.63%、3.38%；峰面積的RSD分別為4.45%、2.67%、4.64%、2.93%、1.81%、3.59%、4.20%、4.39%，符合色譜圖譜的要求，表明精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取6份供試品溶液，按“1.2.3”節(jié)方法進(jìn)樣檢測分析，并且記錄下各個(gè)成分的色譜圖。結(jié)果蘆丁、黃芩苷、千層紙素、漢黃芩苷、黃芩素、鹽酸藥根堿、大黃素、漢黃芩素的保留時(shí)間的RSD分別為0.42%、1.35%、1.62%、0.95%、1.464%、0.66%、2.04%、1.04%，峰面積的RSD分別為1.37%、3.28%、1.63%、3.21%、3.66%、4.58%、4.14%、1.61%，符合色譜圖譜的要求，表明該試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按“1.2.3”節(jié)色譜條件，在溶液制備后的0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行進(jìn)樣檢測分析，記錄色譜圖。結(jié)果蘆丁、黃芩苷、千層紙素、漢黃芩苷黃芩素、鹽酸藥根堿、大黃素、漢黃芩素保留時(shí)間的RSD分別為4.21%、3.66%、3.46%、3.13%、1.46%、0.66%、2.04%、1.04%，峰面積的RSD分別為3.58%、4.72%、4.53%、3.03%、3.66%、4.58%、4.14%、1.62%，符合色譜圖譜的要求，表明在24 h內(nèi)，供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取已知8個(gè)成分含量的半夏瀉心湯1 mL，共6份，分別精密加入含有8種成分的混合對照品溶液，按照“1.2.2”節(jié)制備供試品溶液，并按“1.2.3”節(jié)色譜條件進(jìn)樣檢測，計(jì)算8種成分的加樣回收率，結(jié)果蘆丁、黃芩苷、千層紙素、漢黃芩苷、黃芩素、鹽酸藥根堿、大黃素、漢黃芩素的含量分別為95.0%±2.6%、104.0%±1.7%、101.0%±2.2%、98.0%±1.5%、99.0%±2.4%、100.0%±3.9%、102.0%±4.6%、105.0%±4.0%。

2.7 含量測定

取10批半夏瀉心湯水煎液的濃縮液，分別按照方法“1.2.2”節(jié)制備供試品溶液，并按“1.2.3”節(jié)色譜條件進(jìn)樣檢測，應(yīng)用回歸方程計(jì)算蘆丁、黃芩苷、千層紙素、漢黃芩苷、黃芩素、鹽酸藥根堿、大黃素、漢黃芩素的含量(表3)。半夏瀉心湯樣品檢測顯示，8種成分含量分別為2 298.6±2.12、3 644.2±120.45、1 179±34.07、717.9±2.65、61.1±3.37、48.8±2.66、48.07±1.50、2.78±0.24 μg/mL。

表3 樣品含量測定結(jié)果

續(xù)表3

3 結(jié)論與討論

3.1 煎煮溶劑的選擇

本試驗(yàn)前期在建立半夏瀉心湯的指紋圖譜過程中，對比了水、甲醇、乙酸乙酯等不同溶劑提取液的色譜圖，結(jié)果顯示乙酸乙酯提取的成分相對較少，而甲醇和水提取液的出峰數(shù)量相差不大，但含量有所差異?？紤]目前臨床應(yīng)用的半夏瀉心湯是湯劑形式存在的，為了與臨床使用相同，故在建立含量檢測方法時(shí)仍選擇水為提取溶劑。

3.2 色譜條件的選擇

本文分別采用乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%十二烷基磺酸鈉、乙腈-0.05%三乙胺水溶液(磷酸調(diào) pH為2.0)進(jìn)行梯度洗脫分析[6-7]。結(jié)果表明，乙腈-0.05%三乙胺水溶液(磷酸調(diào) pH為2.0)梯度洗脫系統(tǒng)有助于各色譜峰的分離[8-9]，出峰數(shù)相比其他條件最多，分離度也是最好的。

3.3 波長的選擇

本文采用DAD檢測器進(jìn)行 200～400 nm 范圍全波長掃描，結(jié)果顯示半夏瀉心湯水煎液在280 nm 檢測波長下出峰數(shù)最多，8個(gè)成分均顯示比較好的吸收峰，所以選擇280 nm 作為本試驗(yàn)的檢測波長。

3.4 效應(yīng)成分黃連素的檢測方法

黃連素是半夏瀉心湯中黃連的主要成分，也是目前報(bào)道較多具有明顯誘導(dǎo)小腸Langerhans細(xì)胞合成分泌GLP-1的效應(yīng)成分。但我們在建立檢測色譜分析方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃連中生物堿類成分結(jié)構(gòu)相似，HPLC分析出現(xiàn)部分重合或完全重合等現(xiàn)象，在本文建立的方法中沒有得到很好的分離。為了更好對半夏瀉心湯水煎液進(jìn)行質(zhì)量控制，我們在前面8個(gè)成分檢測的基礎(chǔ)上，另采用藥典方法對黃連素含量進(jìn)行單獨(dú)檢測，作為半夏瀉心湯質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充檢測方法。