天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體多糖

鐘 敏， 湯慶莉， 吳天祥,2,*， 蘆紅云， 聶文強(qiáng)

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 明德學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

灰樹(shù)花(Grifolafrondosa)是一種食藥用真菌, 其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高且生物活性物質(zhì)豐富[1-2]。灰樹(shù)花多糖是最主要的一類活性成分，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，按鏈鍵結(jié)構(gòu)可分為α型與β型，其中具有生物活性作用的多糖大多為β構(gòu)型葡聚糖。β-葡聚糖不僅可構(gòu)筑各種生物的細(xì)胞壁，而且還能參與到各種生化反應(yīng)過(guò)程中[3]。藥食兩用菌β-葡聚糖因其獨(dú)特的生物活性而引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，目前已有大量關(guān)于藥食兩用菌β-葡聚糖生物活性的研究報(bào)道。β-葡聚糖具有抗腫瘤[4-6]、消炎[7-8]、抗病毒[9]、抗氧化[10-11]及抗血栓和抗凝血[12]等作用。因此，β-葡聚糖的研究具有非常重要的意義。

天麻(Rhizomagastrodiae)為我國(guó)名貴中藥材之一，含有的特征成分有天麻素(GA)、對(duì)羥基苯甲醇(HA)、對(duì)羥基苯甲醛(HBA)等[13-15]。研究表明，適量中藥或特殊刺激物在發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加，可促進(jìn)藥用真菌的菌體生長(zhǎng)和活性物質(zhì)的產(chǎn)生。Yang等[16]和Tang等[17]發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加乙醇、乳酸到靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中可顯著促進(jìn)靈芝菌絲體生長(zhǎng)和多糖的合成。

課題組前期研究結(jié)果表明，在灰樹(shù)花液體發(fā)酵體系中添加天麻提取物可顯著促進(jìn)灰樹(shù)花細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖的生物合成[18-22]，而天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花菌絲體多糖及起活性作用的關(guān)鍵成分β-葡聚糖的影響未進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)首先研究了天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體生物量、菌絲體多糖及β-葡聚糖合成量的影響，然后研究了影響它們的關(guān)鍵特征成分及最適添加量，為探明液體深層發(fā)酵提高灰樹(shù)花菌絲體生物量、菌絲體多糖及β-葡聚糖產(chǎn)量提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

灰樹(shù)花：AS51616，中國(guó)微生物菌種保藏管理中心。

天麻，貴州省德江縣天麻基地；對(duì)羥基苯甲醛(144088-50G)、對(duì)羥基苯甲醇(H20806-10G)和β-葡聚糖(G6513-50MG)，美國(guó)Sigma公司；天麻素(20 mg)、纖維素酶(3 U/mg)、果膠酶(40 U/mg)，北京索萊寶科技有限公司；木瓜蛋白酶(1×105U/g)，南寧龐博生物工程有限公司；剛果紅，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，天津市大茂化學(xué)試劑廠；蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司；Na2HPO4·12H2O、無(wú)水乙醇，成都金山化學(xué)試劑有限公司；NaH2PO4·2H2O，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R型立式滅菌鍋、GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、SPX-150B-Z型恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SW-CJ-1D型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SG8200HPT型超聲波清洗機(jī)，上海冠特超聲儀器有限公司；TDL-40B型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；CP114型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；TS-2102C型恒溫振蕩器，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；UV-1800型雙光速紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)斜面培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯(去皮) 200，葡萄糖20，蛋白胨2，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1，瓊脂20，自然pH值條件。

液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨2，酵母膏6，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.5，自然pH值條件。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，蛋白胨5，酵母膏10，KH2PO42，MgSO4·7H2O 2，自然pH值條件。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1斜面種子培養(yǎng)

用接種鏟從母種試管中挑取黃豆粒大小的菌絲塊于PDA斜面培養(yǎng)基中部，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲體長(zhǎng)滿整個(gè)斜面。

1.4.2液體種子培養(yǎng)

用接種勺從斜面種子培養(yǎng)基中刮取蠶豆粒大小的菌絲體，接種于液體培養(yǎng)基中，250 mL錐形瓶裝液量100 mL，25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)4～7 d。

1.4.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

用移液槍按接種量體積分?jǐn)?shù)10%吸取液體種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL錐形瓶裝液量100 mL，25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12 d。

1.5 天麻醇提物制備

參照文獻(xiàn)[23]制備天麻醇提物。天麻清水洗凈后于55 ℃條件下烘干，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩即得天麻粉末。準(zhǔn)確稱取20 g天麻粉末加體積分?jǐn)?shù)75%乙醇200 mL，常溫浸提48 h，過(guò)濾，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，用蒸餾水定容至50 mL，過(guò)濾，濾液用于添加至灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.6 灰樹(shù)花菌絲體多糖及β-葡聚糖的提取

將發(fā)酵液用濾紙過(guò)濾收集菌絲體，蒸餾水洗多次后于55 ℃干燥箱中烘至恒重并研磨成粉末，稱取一定質(zhì)量的灰樹(shù)花菌絲體粉末，加適當(dāng)比例蒸餾水，室溫條件下300 W超聲處理15 min，然后按菌絲體質(zhì)量的1.5%添加復(fù)合酶(纖維素酶∶木瓜蛋白酶∶果膠酶=2∶1∶2)，于50 ℃恒溫水浴鍋中浸提1 h后迅速升溫至90 ℃滅酶10 min，6 000 r/min離心20 min，取上清液加4倍體積乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，4 ℃醇沉24 h，4 000 r/min離心15 min后得沉淀，用乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)清洗沉淀2次，最后將沉淀烘干即得胞內(nèi)多糖。

1.7 分析方法

1.7.1菌絲體干重的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液用濾紙過(guò)濾獲得濕菌絲球，用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲球后，置于55 ℃干燥箱中烘至恒重，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量。1 L發(fā)酵液中所得菌絲體質(zhì)量即為菌絲體干重，單位g/L。

1.7.2菌絲體多糖及β-葡聚糖含量的測(cè)定

將1.6所得沉淀加蒸餾水復(fù)溶，采用苯酚-硫酸法[24]測(cè)多糖含量，剛果紅顯色法[25]測(cè)β-葡聚糖含量，每組處理3個(gè)平行，取各得率的平均值。菌絲體多糖及β-葡聚糖得率計(jì)算公式如式(1)、式(2)：

多糖得率=m(多糖)/m(菌絲體)×100%；

(1)

ω(β-葡聚糖)=m(β-葡聚糖)/m(菌絲體)。

(2)

式(1)、式(2)中，m(多糖)、m(菌絲體)，g；m(β-葡聚糖)，mg。

1.7.3高效液相色譜分析

取1 mL天麻醇提液過(guò)0.45 μm超濾膜后用HPLC法檢測(cè)[2]。色譜柱為Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸(A)和乙腈(C)。梯度洗脫：0～35 min，體積分?jǐn)?shù)3%～30%C；35～40 min，體積分?jǐn)?shù)30%～100%C；40～45 min，體積分?jǐn)?shù)100%～3%C。柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)221 nm。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0軟件分析顯著性，用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻醇提物添加量對(duì)灰樹(shù)花菌絲體生物量、菌絲體多糖及β-葡聚糖的影響

在灰樹(shù)花發(fā)酵體系中添加不同質(zhì)量濃度的天麻醇提物(1～13 g/L)，并以空白組作對(duì)照，發(fā)酵12 d后測(cè)定比較各處理對(duì)灰樹(shù)花菌絲體干重、菌絲體多糖及β-葡聚糖的影響，其結(jié)果如圖1、圖2。隨天麻醇提物質(zhì)量濃度的增加，灰樹(shù)花菌絲體干重、菌絲體多糖及β-葡聚糖整體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。由圖1可知，天麻醇提物的各處理組中，灰樹(shù)花菌絲體干重均高于空白組，并且添加量在3～13 g/L促進(jìn)作用具有顯著性(P<0.05)，在添加量為7 g/L時(shí)促進(jìn)效果最好(此結(jié)果與賀宗毅等[22]和Wu等[23]研究結(jié)果一致), 此時(shí)菌絲體干重達(dá)最大值1.708 g/L，與空白對(duì)照組相比增加了35.56%。隨天麻醇提物質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大，菌絲體生物量有所降低，可能是因?yàn)樘炻榇继嵛镏写嬖谥恍┮种苹覙?shù)花生長(zhǎng)的成分，在天麻醇提物質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)抑制因子的作用增強(qiáng)。

圖1 天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花菌絲體生物量的影響Fig.1 Effect of concentrations of R. gastrodiae ethanol extract on mycelia biomass by submerged culture of Grifola frondosa

圖2 天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花菌絲體多糖和β-葡聚糖的影響Fig.2 Effect of concentrations of R. gastrodiae ethanol extract on mycelia polysaccharides and β-glucan by submerged culture of Grifola frondosa

由圖2可知，天麻醇提物的各處理組中，灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體多糖及β-葡聚糖含量均高于空白組，添加量在7～11 g/L和5～13 g/L分別能顯著增加灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖和β-葡聚糖的含量(P<0.05)。其中在添加量為7 g/L時(shí)效果最佳，此時(shí)胞內(nèi)多糖和β-葡聚糖的含量分別達(dá)到5.974%和2.055 mg/g，與空白對(duì)照組相比分別增加了128.84%和143.74%。結(jié)果表明，添加適當(dāng)質(zhì)量濃度的天麻醇提物能夠提高灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖及β-葡聚糖的含量，可能是因?yàn)檫m當(dāng)質(zhì)量濃度的天麻醇提物促進(jìn)了葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，加速了葡萄糖向糖原轉(zhuǎn)化[26]，從而提高了多糖的含量，同時(shí)天麻醇提物的添加還可能改變了多糖的合成方式，從而使多糖的構(gòu)型發(fā)生了改變，使β-葡聚糖的含量提高，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

2.2 天麻醇提物特征成分定量分析

前期課題組研究結(jié)果表明，在經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌后天麻醇提物中的特征成分含量會(huì)發(fā)生很大的變化[27]。由于天麻醇提物參與灰樹(shù)花深層發(fā)酵前需經(jīng)高溫高壓滅菌，因此在探究何種特征成分對(duì)灰樹(shù)花菌絲體多糖及β-葡聚糖含量影響最顯著時(shí)應(yīng)按滅菌后的含量添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中。天麻醇提物滅菌后的高效液相色譜圖如圖3，通過(guò)與混合標(biāo)準(zhǔn)品譜圖(圖4)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，天麻醇提物的特征成分含天麻素、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲醇，其含量分別為天麻素5.838 mg/g，對(duì)羥基苯甲醛1.107 mg/g，對(duì)羥基苯甲醇0.660 mg/g。

圖3 天麻醇提物高效液相色譜Fig.3 HPLC chromatogram of R. gastrodiae ethanol extract

圖4 GA、HA、HBA混合標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜Fig.4 HPLC chromatogram of mixed standard of GA, HA and HBA

2.3 天麻醇提物不同特征成分對(duì)灰樹(shù)花菌絲體生物量、菌絲體多糖及β-葡聚糖的影響

以滅菌后7 g天麻醇提物中所含GA、HA和HBA的量分別添加至灰樹(shù)花發(fā)酵體系中，即實(shí)驗(yàn)組分別為天麻醇提物7 g/L，GA 40.9 mg/L，HA 4.6 mg/L，HBA 7.8 mg/L，探究影響灰樹(shù)花菌絲體生物量、菌絲體多糖及β-葡聚糖含量的關(guān)鍵特征成分，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。整體來(lái)看，4組實(shí)驗(yàn)組相比于空白組均能一定程度提高灰樹(shù)花菌絲體生物量、菌絲體多糖及β-葡聚糖的含量；而單獨(dú)添加3種天麻特征成分的實(shí)驗(yàn)組中，HBA提高灰樹(shù)花菌絲體生物量、菌絲體多糖及β-葡聚糖的含量效果最佳，但都低于天麻醇提物實(shí)驗(yàn)組。初步斷定HBA可能是天麻醇提物中提高灰樹(shù)花菌絲體生物量、菌絲體多糖及β-葡聚糖含量的關(guān)鍵成分，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)關(guān)鍵特征成分的最適添加量進(jìn)行研究。

圖5 天麻醇提物特征成分對(duì)灰樹(shù)花菌絲體生物量的影響Fig.5 Effect of characteristic components of R. gastrodiae ethanol extract on mycelia biomass by submerged culture of Grifola frondosa

圖6 天麻特征成分對(duì)灰樹(shù)花菌絲體多糖和β-葡聚糖的影響Fig.6 Effect of characteristic components of R. gastrodiae ethanol extract on mycelia polysaccharides and β-glucan by submerged culture of Grifola frondosa

2.4 天麻醇提物特征成分添加量對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體生物量的影響

為進(jìn)一步確定對(duì)羥基苯甲醛是否是促進(jìn)灰樹(shù)花菌絲體生物量的關(guān)鍵成分及其最適添加濃度，在灰樹(shù)花發(fā)酵體系中分別添加不同質(zhì)量濃度的3種單一天麻特征成分，發(fā)酵12 d后分別測(cè)定灰樹(shù)花菌絲體生物量，結(jié)果如圖7。菌絲體干重隨3種單一天麻特征成分質(zhì)量濃度的增大整體呈先增加至最大值然后降低的趨勢(shì)。與空白組相比，天麻素質(zhì)量濃度在50～200 mg/L時(shí)可促進(jìn)灰樹(shù)花菌絲體生長(zhǎng)但效果不顯著(P>0.05)，質(zhì)量濃度在250～350 mg/L時(shí)表現(xiàn)出抑制作用；對(duì)羥基苯甲醇質(zhì)量濃度在50～300 mg/L時(shí)可不同程度促進(jìn)灰樹(shù)花菌絲體生長(zhǎng)，但在200 mg/L時(shí)促進(jìn)效果顯著；對(duì)羥基苯甲醛質(zhì)量濃度在100～150 mg/L時(shí)均可顯著促進(jìn)灰樹(shù)花菌絲體生長(zhǎng)(P<0.05)，其中對(duì)羥基苯甲醇和對(duì)羥基苯甲醛質(zhì)量濃度分別為200 mg/L和100 mg/L時(shí)效果最佳，菌絲體干重最大值分別為1.577 g/L和1.653 g/L,與空白組比較，分別增加了28.63%和34.83%。因此，在3種天麻特征成分的添加中，100 mg/L對(duì)羥基苯甲醛對(duì)灰樹(shù)花菌絲體生物量的促進(jìn)效果是較優(yōu)的。

圖7 天麻醇提物特征成分添加量與灰樹(shù)花菌絲體生物量的關(guān)系Fig.7 Effect of various concentrations of GA, HA and HBA on mycelia biomass by submerged culture of Grifola frondosa

2.5 天麻醇提物特征成分添加量對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體多糖的影響

為確定3種天麻特征成分對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖影響的關(guān)鍵成分及最適添加量，向灰樹(shù)花發(fā)酵體系中分別添加不同質(zhì)量濃度的3種單一天麻特征成分，發(fā)酵12 d后分別測(cè)定灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖含量，結(jié)果如圖8。從整體看來(lái)，隨3種天麻特征成分添加量的增大，胞內(nèi)多糖的含量先逐漸增大至最大值，隨后又逐漸降低。與空白組比較，天麻素質(zhì)量濃度在50～150 mg/L時(shí)均可促進(jìn)胞內(nèi)多糖的合成但效果不顯著(P>0.05)，質(zhì)量濃度在250～350 mg/L時(shí)表現(xiàn)出抑制作用；添加對(duì)羥基苯甲醇和對(duì)羥基苯甲醛的實(shí)驗(yàn)組相比空白組均能一定程度提高灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖的含量，并且在150～350 mg/L時(shí)，對(duì)羥基苯甲醛對(duì)胞內(nèi)多糖含量的影響均高于其他2種特征成分，其中對(duì)羥基苯甲醛添加量為250 mg/L時(shí)對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖合成的促進(jìn)作用效果較優(yōu)。因此，3種天麻特征成分中對(duì)羥基苯甲醛對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖合成的促進(jìn)作用最大，其優(yōu)化添加量為250 mg/L。

圖8 天麻醇提物特征成分添加量與灰樹(shù)花菌絲體多糖的關(guān)系Fig.8 Effect of various concentrations of GA, HA and HBA on mycelia polysaccharides by submerged culture of Grifola frondosa

2.6 天麻醇提物特征成分添加量對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體β-葡聚糖的影響

將不同濃度的3種天麻特征成分分別添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，探究對(duì)灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖影響的關(guān)鍵特征成分及其最適添加量，發(fā)酵12 d后分別測(cè)定其菌絲體β-葡聚糖含量，結(jié)果如圖9。整體看來(lái)，灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖含量隨添加物質(zhì)量濃度的增大先增加至最大值后降低。添加物質(zhì)量濃度為50～250 mg/L時(shí)，對(duì)羥基苯甲醇和對(duì)羥基苯甲醛均能一定程度提高灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖的含量；天麻素質(zhì)量濃度為50～200 mg/L時(shí)，對(duì)β-葡聚糖含量的影響是起促進(jìn)作用的，后隨添加量繼續(xù)增大菌絲體β-葡聚糖的合成作用受到抑制。對(duì)羥基苯甲醛的添加量為150 mg/L時(shí)，對(duì)菌絲體β-葡聚糖合成的促進(jìn)作用較優(yōu)。

圖9 天麻醇提物特征成分添加量與灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖的關(guān)系Fig.9 Effect of various concentrations of GA, HA and HBA on mycelia β-glucan by submerged culture of Grifola frondosa

3 結(jié) 論

主要研究了天麻醇提物的特征成分對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體生長(zhǎng)、菌絲體多糖及β-葡聚糖的影響。不同濃度的天麻醇提物均能一定程度促進(jìn)灰樹(shù)花菌體的生長(zhǎng)、菌絲體多糖及β-葡聚糖的合成，在其質(zhì)量濃度為7 g/L時(shí)促進(jìn)效果較優(yōu)。利用高效液相色譜對(duì)7 g/L天麻醇提物中的特征成分進(jìn)行定量分析，所得天麻素、對(duì)羥基苯甲醇和對(duì)羥基苯甲醛的含量分別為5.837 5、1.107 2、0.660 1 mg/g。將滅菌后7 g/L天麻醇提物中所含的3種單一成分分別添加到培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲醛是均能顯著促進(jìn)灰樹(shù)花菌絲體生長(zhǎng)、菌絲體多糖和β-葡聚糖合成的關(guān)鍵特征成分，其優(yōu)化添加量分別為100、250、150 mg/L。天麻醇提物影響胞內(nèi)多糖及β-葡聚糖合成的機(jī)理可能是因?yàn)椴煌炻榇继嵛锾砑恿坑绊懥似咸烟堑霓D(zhuǎn)運(yùn)，改變了葡萄糖向糖原轉(zhuǎn)化，從而影響了胞內(nèi)多糖的合成，同時(shí)天麻醇提物的添加還可能改變了多糖的合成方式，從而使多糖的構(gòu)型發(fā)生了改變，使β-葡聚糖的含量發(fā)生改變，具體原因還有待進(jìn)一步研究。