蔗糖異構(gòu)酶PalI包埋和交聯(lián)固定化方法比較

王兵兵， 張永吉， 李憲臻， 李 蓉

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

異麥芽酮糖是蔗糖的一種同分異構(gòu)體，其甜度為蔗糖的52%[1]，理化性質(zhì)類似蔗糖[2]。異麥芽酮糖大量食用后在血液中釋放單糖緩慢，有助于糖尿病的防治以及阻止脂肪的過渡積累[3-4]，因此在食品工業(yè)上可以廣泛替代蔗糖作為甜味劑。來自Klebsiellasp. LX3的蔗糖異構(gòu)酶PalI，能夠催化蔗糖生成83%的異麥芽酮糖(α-D-glucosylpyranosyl-1,6-D-fructofranose)和21%海藻酮糖(α-D-glucosylpyranosyl-1,1-D-fructofranose)[5]，故可以作為一種良好的異麥芽酮糖產(chǎn)生酶。在異麥芽酮糖生產(chǎn)中，核心問題為產(chǎn)物的純化分離，使用游離酶進(jìn)行生產(chǎn)發(fā)酵會(huì)增加產(chǎn)物分離難度，蔗糖異構(gòu)酶的固定化成為解決問題的途徑之一，但是近年來卻少有相關(guān)成果的報(bào)道。酶的固定化是指用理化方法將游離酶固定在相應(yīng)空間區(qū)域，但仍保留其催化特性，并可回收和重復(fù)使用的一類技術(shù)[6-7]。固定化技術(shù)可提高酶的穩(wěn)定性，且易于從體系中分離回收固定化酶，并可重復(fù)實(shí)驗(yàn)降低應(yīng)用成本[8-9]。本研究擬分別采用較低成本的海藻酸鈉包埋法和戊二醛交聯(lián)法對(duì)蔗糖異構(gòu)酶PalI進(jìn)行固定化，希望通過對(duì)這兩種結(jié)果的比較，探索蔗糖異構(gòu)酶固定化酶的實(shí)用性和可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蔗糖異構(gòu)酶PalI(NCBI accession number AAK82938)來源于Klebsiellasp. LX3；大腸桿菌BL21(DE3)和pET28a，中科院大連物理化學(xué)研究所趙宗保研究員課題組；IPTG、卡那霉素、胰蛋白胨、酵母浸粉，生工生物工程(上海)有限公司；無水CaCl2、NaCl、(NH4)2SO4、 3，5-二硝基水楊酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；蔗糖、戊二醛、檸檬酸，科密歐化學(xué)試劑廠；海藻酸鈉，光復(fù)精細(xì)化工研究所。以上所有試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SpectraMax Paradigm型酶標(biāo)儀 ，美谷分子儀器公司；JY98-IIIN型細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技公司；5804R型離心機(jī)，美國Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1蔗糖異構(gòu)酶PalI的表達(dá)

將重組菌pET28a-palI/E.coliBL21在LB卡那霉素抗性平板上復(fù)蘇培養(yǎng)，挑取單菌落制備種子液，按照1∶100體積比接種于200 mL培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，16 ℃、200 r/min 培養(yǎng)18 h后離心富集菌體。通過超聲破碎，提取得到重組PalI酶液。

1.3.2PalI酶活測定

游離酶50 μL或者固定化酶1 g，與2 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的蔗糖在30 ℃、160 r/min的搖床上反應(yīng)2 h，使用DNS方法測產(chǎn)生的還原糖，并根據(jù)還原糖量計(jì)算酶活。

蔗糖異構(gòu)酶酶活定義：使用蔗糖做底物，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化生成1 μmol還原糖所需的酶量。

相對(duì)酶活定義：設(shè)定同組酶活最高的相對(duì)酶活為100%，以同組最高酶活為參照，計(jì)算出的比值為相對(duì)酶活。

1.3.3海藻酸鈉、CaCl2、戊二醛濃度的確定

配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～4%的海藻酸鈉溶液和CaCl2溶液。將1 mL蔗糖異構(gòu)酶與海藻酸鈉溶液混合均勻，用注射器逐滴加入到CaCl2溶液中，固定20 min得到直徑2 mm左右的微球。將固定化酶過濾，并用純水洗3遍，裝入離心管中，在所得固定化酶中加入2%的蔗糖溶液2 mL，于30 ℃，160 r/min反應(yīng)2 h。使用DNS檢測還原糖的濃度。

在5 mL蔗糖異構(gòu)酶中，加入4.5 g (NH4)2SO4進(jìn)行沉淀，然后分別與1%～4%的戊二醛在合適條件交聯(lián)2 h；4 ℃離心取沉淀并清洗、干燥保存。將干燥的固定化酶與6 mL 2%蔗糖溶液混合，在30 ℃，60 r/min條件反應(yīng)2 h，確定還原糖濃度。

1.3.4固定化酶的最適pH值、最適溫度和操作穩(wěn)定性的確定

將固定化酶分別與6 mL、pH值3～8、2%的蔗糖溶液混合，在適宜條件反應(yīng)，使用DNS法測還原糖濃度；將處于最適pH值的固定化酶分別放置于30～80 ℃條件反應(yīng)，確定最適溫度；將固定化酶從最適反應(yīng)體系中過濾出并用純水清洗，反復(fù)進(jìn)行11次操作；4 ℃保存20 d，每天測定剩余酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 PalI的表達(dá)與活性檢測結(jié)果

分別對(duì)pET28a-palI/E.coliBL21重組菌株及對(duì)照組pET28a/E.coliBL21菌株進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果見圖1。圖1(a)中，在60 kDa附近有一條明顯差異蛋白條帶，與理論P(yáng)alI蛋白大小值相同。圖1(b)中，通過TLC分析，表達(dá)的酶液具有水解轉(zhuǎn)化蔗糖成為異麥芽酮糖的蔗糖異構(gòu)酶活性。

①蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品 ②異麥芽酮糖標(biāo)準(zhǔn)品 ③蔗糖反應(yīng)混合物圖1 蔗糖異構(gòu)酶的表達(dá)與活性分析Fig.1 Expression and activity analysis of sucrose isomerase

2.2 固定化條件的優(yōu)化

2.2.1海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活性的影響

海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活性影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于1.5%，蔗糖異構(gòu)酶酶活隨海藻酸鈉濃度的升高而升高；大于1.5%，酶活隨海藻酸鈉濃度增大反而呈下降趨勢。原因可能是海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于1.5%，隨其濃度升高，包埋體網(wǎng)孔逐漸變密，能縛住更多的酶蛋白；另外，網(wǎng)孔大有利于酶蛋白與底物結(jié)合。隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過1.5%，可能使得網(wǎng)孔致密，阻礙酶蛋白與底物結(jié)合，使底物轉(zhuǎn)化能力下降[10]。

圖2 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活性影響Fig.2 Effect of sodium alginate concentrations on activity of immobilized enzyme

2.2.2CaCl2濃度對(duì)固定化酶活性的影響

CaCl2濃度對(duì)固定化酶活性影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可知，在CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～2.0%，隨其濃度上升，酶活逐漸升高；而當(dāng)CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過2.0%時(shí)，隨其濃度升高，酶活逐漸降低。原因可能為CaCl2主要影響的是交聯(lián)程度，Ca2+濃度低時(shí)，使得網(wǎng)孔大易與底物接觸；而當(dāng)Ca2+濃度高時(shí)，其網(wǎng)格結(jié)構(gòu)致密，使得底物與酶接觸難度增大[11-12]。

圖3 CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活性影響Fig.3 Effect of CaCl2 concentrations on activity of immobilized enzyme

2.2.3戊二醛濃度對(duì)固定化酶活性的影響

戊二醛為雙功能基團(tuán)交聯(lián)劑，可通過與蛋白質(zhì)中氨基的作用發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。圖4中，戊二醛最適體積分?jǐn)?shù)為2.5%，原因可能是在低戊二醛濃度時(shí)，隨著戊二醛濃度的增加，交聯(lián)體中蛋白酶的數(shù)量也會(huì)增加，從而使得固定化酶的活性增高；當(dāng)戊二醛濃度過大時(shí)，戊二醛易發(fā)生自聯(lián)反應(yīng)，或者與酶蛋白上的氨基交聯(lián)過多，從而令酶活下降，且聚集體過密阻礙了酶與底物的接觸[13-14]。

圖4 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活性的影響Fig.4 Effect of flutaraldehyde concentrations on activity of immobilized enzyme

2.3 固定化酶學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性分析

2.3.1pH值對(duì)固定化酶活性的影響

將固定化酶和游離酶分別置于pH值3～8檸檬酸- 磷酸氫二鈉緩沖溶液中反應(yīng)2 h。通過測定還原糖的產(chǎn)生量來確定酶活的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可知，海藻酸鈉包埋法獲得固定化酶最適pH值為6.0，戊二醛交聯(lián)法獲得的固定化酶最適pH值為5.0，游離酶的最適pH值為5.0～6.0。由此可以看出，海藻酸鈉固定化酶的最適pH值高于游離酶，而戊二醛固定化酶的最適pH值低于游離酶。這種現(xiàn)象可能是由于海藻酸鈉和戊二醛兩種材料各自的性質(zhì)決定的。如果采用戊二醛和海藻酸鈉雙固定的方法對(duì)蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定化，則可能得到具有更寬pH值范圍的海藻酸鈉/戊二醛固定化酶。

圖5 pH值對(duì)酶活性的影響Fig.5 Effect of pH on activity of free enzyme and immobilized enzyme

2.3.2溫度對(duì)固定化酶活性的影響

在固定化酶和游離酶最適反應(yīng)條件下，將其分別置于20～80 ℃，反應(yīng)2 h后測定還原糖產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。由圖6可知，海藻酸鈉固定化酶的最適溫度在30 ℃，戊二醛交聯(lián)酶的最適溫度在50 ℃，但都與游離酶的最適反應(yīng)溫度70 ℃相比存在差距。主要原因可能是固定化酶所固定的酶量不及同體積條件下的游離酶多，故在高溫條件下，由于半衰期問題使得固定化酶的反應(yīng)性大大降低[15]。

圖6 溫度與固定化酶活性的關(guān)系Fig.6 Effect of temperature on activity of immobilized enzyme

2.3.3固定化酶的穩(wěn)定性分析

與游離酶相比，固定化酶可以重復(fù)多次使用，因此循環(huán)使用次數(shù)和儲(chǔ)存穩(wěn)定性也作為固定化酶實(shí)用性強(qiáng)弱的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。由圖7可知，海藻酸鈉包埋酶使用4次，酶活性降到20%左右，戊二醛交聯(lián)酶的使用次數(shù)高達(dá)12次，其殘余酶活仍為80%。隨著使用次數(shù)的增加，固定化酶的相對(duì)酶活均逐漸下降，這主要是固定化酶在機(jī)械損傷下導(dǎo)致酶分子泄漏所致[16]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。圖8中，在20 d內(nèi)固定化酶的剩余酶活接近80%，而游離酶的酶活已經(jīng)低于30%。由此可見，固定化酶能顯著提高蔗糖異構(gòu)酶的利用率，降低酶的生產(chǎn)成本。

圖7 固定化酶循環(huán)使用次數(shù)與酶活性的關(guān)系Fig.7 Relationship between recycle numbers and enzyme activity of immobilized enzyme

圖8 固定化酶儲(chǔ)存時(shí)間與酶活性的關(guān)系Fig.8 Relationship between storage stability and enzyme activity of immobilized enzyme

3 結(jié) 論

分別以海藻酸鈉和戊二醛兩種化合物作為單一載體，對(duì)蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定化。實(shí)驗(yàn)分析得出：海藻酸鈉包埋蔗糖異構(gòu)酶PalI時(shí)，最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，CaCl2最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%；戊二醛交聯(lián)固定蔗糖異構(gòu)酶PalI時(shí)，戊二醛最適體積分?jǐn)?shù)為2.5%。海藻酸鈉固定化酶4 ℃保存20 d，酶活力保持在60%左右，戊二醛交聯(lián)酶活性在95%以上，而游離酶活性僅為30%左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，戊二醛交聯(lián)酶的循環(huán)利用次數(shù)和儲(chǔ)存穩(wěn)定性明顯優(yōu)于海藻酸鈉包埋酶，且與游離酶相比更穩(wěn)定，固定化的蔗糖異構(gòu)酶在生產(chǎn)實(shí)際中實(shí)用性更強(qiáng)。