茶樹(shù)腋芽多倍體誘導(dǎo)與快速鑒定方法研究

翟秀明 ，唐 敏 ，鄔秀宏 ，羅紅玉 ，侯渝嘉 *

（1.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，重慶永川 402160；2.重慶市茶葉工程技術(shù)研究中心，重慶永川 402160）

茶是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，屬于山茶科山茶屬，一般為二倍體。1932年，K.Karasawa[1]對(duì)茶葉細(xì)胞學(xué)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)了茶樹(shù)中有三倍體存在，正式拉開(kāi)了茶樹(shù)多倍體研究的序幕。茶樹(shù)多倍體具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、內(nèi)含物多、光合效率強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛、可育性降低、發(fā)芽早等特點(diǎn)，可明顯提高茶葉的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性，且經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)新的性狀，極大地豐富了茶樹(shù)的遺傳多樣性，為茶樹(shù)新品種的培育提供新的種質(zhì)資源。茶樹(shù)多為無(wú)性繁殖并以芽葉為收獲對(duì)象，這一特點(diǎn)使茶樹(shù)能夠穩(wěn)定地遺傳保存多倍化帶來(lái)的優(yōu)良性狀，更好地利用多倍體優(yōu)勢(shì)[2-5]。但與其他物種相比，茶樹(shù)多倍體育種研究較滯后且熱度較低，在茶樹(shù)多倍體人工誘導(dǎo)方面，國(guó)內(nèi)研究起步較晚且研究較少，現(xiàn)有研究報(bào)道多數(shù)以茶樹(shù)種子、扦插苗、實(shí)生苗以及茶樹(shù)短穗等為誘導(dǎo)材料，采用浸漬、涂抹、滴液和注射法進(jìn)行了茶樹(shù)多倍體誘導(dǎo)，這些方法均需多次重復(fù)操作，工作量大，且誘導(dǎo)率較低[6-10]。在茶樹(shù)倍性快速鑒定方面，陳士炎等[11]研究了茶樹(shù)倍性與氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體的關(guān)系，有關(guān)氣孔其他性狀與茶樹(shù)倍性之間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以春季剛萌發(fā)的茶樹(shù)腋芽為誘導(dǎo)材料，采用改良的瓊脂包裹法，研究了不同秋水仙素濃度和處理時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)效率的影響，并探討了茶樹(shù)倍性與氣孔性狀之間的關(guān)系，以期為茶樹(shù)多倍體誘導(dǎo)以及茶樹(shù)倍性鑒定提供新的方法和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為二倍體茶樹(shù)材料黃山苦茶與黃觀音。由于茶樹(shù)樹(shù)齡較高，試驗(yàn)開(kāi)始前一年春茶結(jié)束后將試驗(yàn)材料進(jìn)行重修剪，以促進(jìn)茶樹(shù)側(cè)枝及腋芽的萌發(fā)。所有供試材料均來(lái)源于重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所資源圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 瓊脂濃度選擇

設(shè)置 0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%9個(gè)水平瓊脂濃度，將其包裹到茶樹(shù)腋芽上，于 6、24、48、72 h 時(shí)觀察瓊脂套形態(tài)。

1.2.2 多倍體誘導(dǎo)

選取春天剛萌動(dòng)的茶樹(shù)腋芽為試驗(yàn)材料，用含有 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%秋水仙素的瓊脂膠套包裹，膠套外包裹一層保鮮膜，處理 2、4、6、8、10、12 d后，去除膠套，整個(gè)處理過(guò)程需在遮蔭條件下進(jìn)行。

1.2.3 多倍體觀察鑒定

形態(tài)變異觀察：在誘變處理后，定期觀察誘變腋芽生長(zhǎng)發(fā)育狀況，觀察測(cè)量其葉長(zhǎng)、葉寬、葉片形狀、葉脈、葉色、葉片厚度、節(jié)間長(zhǎng)短等性狀，對(duì)差異較明顯的植株掛牌標(biāo)記進(jìn)行初步篩選，并對(duì)成活率和形態(tài)變異數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

染色體計(jì)數(shù)：選取秋水仙素處理后茶樹(shù)新梢的葉原基，經(jīng)0.002 mol/L的8-羥基喹啉常溫黑暗處理3 h后，將材料浸泡于卡諾固定液（乙醇∶乙酸=3∶1）中，4℃固定24 h。之后采用等體積比的濃鹽酸乙醇混合液常溫解離20 min，無(wú)菌水漂洗5次，用改良的苯酚品紅溶液染色，常規(guī)壓片法壓片。選取染色體分散、清晰的細(xì)胞，使用奧林巴斯CX31生物顯微鏡觀察染色體條數(shù)。

1.2.4 二倍體與四倍體觀察比較

試驗(yàn)對(duì)不同倍性的茶樹(shù)新梢進(jìn)行氣孔保衛(wèi)細(xì)胞和葉綠體數(shù)目的觀察和測(cè)量，用鑷子撕取一小塊茶葉下表皮朝上放于載玻片上，滴加1滴1%的碘-碘化鉀溶液，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡（40×）下觀察。每個(gè)變異新稍上的葉片統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野的氣孔數(shù)目，取平均值作為氣孔密度，測(cè)量5個(gè)氣孔的長(zhǎng)度、寬度以及葉綠體的個(gè)數(shù)，重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

測(cè)得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行整理，用SPSS Statistics 19.0進(jìn)行相關(guān)性分析、差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)腋芽多倍體誘導(dǎo)最佳條件組合研究

2.1.1 瓊脂濃度的選擇

瓊脂濃度確定如表1所示。光照和風(fēng)吹會(huì)造成瓊脂套水分的蒸發(fā)，濃度較低的瓊脂套隨著時(shí)間的延長(zhǎng)最終會(huì)風(fēng)干形成一層瓊脂薄膜，緊裹在芽頭上，不易撕取，替換新瓊脂套則容易造成芽頭的掉落，不利于試驗(yàn)的順利進(jìn)行，瓊脂濃度過(guò)高，則會(huì)造成瓊脂套質(zhì)地較脆，容易斷裂脫落。經(jīng)試驗(yàn)觀察，最終確定瓊脂濃度為3.0%，并在瓊脂套的表面包裹一層保鮮膜以減少水分的蒸發(fā)。

表1 瓊脂濃度確定Table 1 Agar concentration select

2.1.2 秋水仙素濃度及處理時(shí)間對(duì)茶樹(shù)腋芽成活率和形態(tài)變異的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)秋水仙素處理后，腋芽會(huì)變褐，有些可以正常生長(zhǎng)，有些則逐漸死亡，與同時(shí)期正常二倍體新梢相比（圖1A），有些多倍化新梢會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，節(jié)間變短，葉色變綠，葉肉增厚，葉質(zhì)變硬，葉片凹凸不平，葉脈分義（圖1B），莖稈變粗，腋芽遲遲不發(fā)育，變矮胖（圖1C），葉片尖端皺縮，向內(nèi)凹陷，葉片生有麻斑，扭曲（圖1D），葉片形狀發(fā)生改變，葉片狹長(zhǎng)，葉色深綠（圖1E），葉緣鋸齒較稀或消失，葉片生長(zhǎng)怪異，葉片之上再生葉片（圖1F），嫩葉顏色發(fā)生改變，變?yōu)樽霞t色（圖1G）等變異。

圖1 秋水仙素處理后形態(tài)變異Figure 1 Morphological variation after colchicine treatment

對(duì)其成活率和形態(tài)變異率（圖2～圖3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，隨著秋水仙素濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，茶樹(shù)腋芽成活率呈降低的趨勢(shì)，且不同處理時(shí)間和處理濃度之間腋芽成活率變異較大，說(shuō)明茶樹(shù)腋芽對(duì)秋水仙素的敏感程度較高，耐受力較弱。0.4%和0.5%濃度的秋水仙素對(duì)茶樹(shù)腋芽有較強(qiáng)的毒害作用，成活率均低于50%；0.3%和0.4%濃度的秋水仙素的處理時(shí)間達(dá)到12 d，0.5%濃度的秋水仙素的處理時(shí)間達(dá)到8 d時(shí)，成活率趨近零；0.3%濃度的秋水仙素處理4 d茶樹(shù)腋芽的形態(tài)變異率最高（53.33%），此時(shí)茶樹(shù)腋芽的成活率為 63.33%，總體成活率較高；0.2%濃度的秋水仙素處理6d腋芽的變異率次之（50%），此時(shí)總體成活率為56.67%。在0.3%濃度下處理4 d，能獲得最高的變異率和較高的存活率。

圖2 秋水仙素濃度與處理時(shí)間對(duì)成活率的影響Figure 2 Effect of colchicine concentration and treatment time on survival rate

圖3 秋水仙素濃度與處理時(shí)間對(duì)形態(tài)變異率的影響Figure 3 Effect of colchicine concentration and treatment time on morphological variation

2.1.3 不同組合條件對(duì)茶樹(shù)腋芽多倍體變異率的影響

對(duì)秋水仙素誘導(dǎo)后茶樹(shù)新梢的葉原基進(jìn)行染色體數(shù)目的鑒定，結(jié)果表明，在秋水仙素誘導(dǎo)后，有些茶樹(shù)新梢染色體數(shù)目倍性增加，成功誘導(dǎo)為四倍體，染色體數(shù)目為 60（2n=4x=60）條（圖4），有些茶樹(shù)新梢染色體數(shù)目保持不變，沒(méi)有加倍成功，仍為二倍體，染色體數(shù)目為 30（2n=2x=30）條（圖4）。

圖4 茶樹(shù)四倍體及二倍體染色體圖片(100×)Figure 4 Chromosome pictures of the tetraploid and diploid in tea(100×)

根據(jù)染色體鑒定結(jié)果，對(duì)不同組合條件誘變茶樹(shù)腋芽的變異情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，由圖5可以看出，在0.1%～0.3%濃度范圍內(nèi)隨著秋水仙素濃度的增加，多倍體變異率升高，秋水仙素濃度達(dá)到0.3%時(shí)，變異率最高，達(dá)到40%，當(dāng)秋水仙素濃度大于0.3%時(shí)，多倍體誘導(dǎo)率降低。從調(diào)查結(jié)果可看出處理時(shí)間對(duì)多倍體的誘導(dǎo)率影響顯著，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理濃度下的多倍體誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)秋水仙素濃度為0.3%，處理時(shí)間為4 d時(shí)，誘導(dǎo)率高達(dá)40%，誘導(dǎo)效果最佳；當(dāng)秋水仙素濃度為0.2%，處理時(shí)間為6 d時(shí)，誘導(dǎo)率為33.33%，誘導(dǎo)效果次之，這與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

圖5 多倍化變異率統(tǒng)計(jì)Figure 5 Statistics of multiploidy variation

2.2 茶樹(shù)倍性快速鑒定

2.2.1 葉綠體數(shù)目鑒定茶樹(shù)倍性

由表2所示，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不同倍性茶樹(shù)之間氣孔保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體的數(shù)目差異較大（圖6、圖7），二倍體茶樹(shù)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目在11～16之間，變異系數(shù)為10.52%，結(jié)合圖8可以看出，二倍體茶樹(shù)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目多數(shù)為12～14；四倍體在 18～34 之間，變異系數(shù)為 11%，多數(shù)為24～30，在觀察的所有四倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中，只有極少數(shù)葉綠體數(shù)目低于24。差異顯著性檢驗(yàn)（t檢驗(yàn)）結(jié)果顯示，二倍體與四倍體茶樹(shù)之間葉綠體數(shù)目差異達(dá)極顯著水平（t=-27.34）。二倍體茶樹(shù)葉綠體數(shù)平均值為 13.59，四倍體茶樹(shù)保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體平均值為27.18，兩者之間的比例符合其染色體數(shù)目之比2∶1，相關(guān)性分析顯示茶樹(shù)倍性與保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體的數(shù)目呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.952，且二倍體與四倍體保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目無(wú)交叉。因此，葉綠體數(shù)目的平均值可以作為茶樹(shù)染色體倍性鑒定的可靠依據(jù)。

表2 茶樹(shù)二倍體與四倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目比較Table 2 Comparison of stomata guard cell chloroplast number between diploid and tetraploid tea

圖6 二倍體（40×）Figure 6 Diploid

圖7 四倍體（40×）Figure 7 Tetraploid

2.2.2 氣孔密度與氣孔長(zhǎng)、寬鑒定茶樹(shù)倍性

圖8 茶樹(shù)不同倍性植株氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體分布Figure 8 Distribution of stomata guard cell chloroplast number of different ploidy tea plants

由表3所示，對(duì)茶樹(shù)染色體數(shù)目與氣孔密度之間進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.488，二倍體與四倍體茶樹(shù)的氣孔密度之間差異達(dá)極顯著水平，說(shuō)明氣孔密度可以作為鑒定染色體倍性的依據(jù)。但結(jié)合圖9可以看出，相同倍性間氣孔密度變異幅度較大，二倍體茶樹(shù)氣孔密度的變異幅度為17～33，變異系數(shù)達(dá)16.18%，四倍體茶樹(shù)氣孔密度的變異幅度為14～27，變異系數(shù)達(dá)18.43%，同時(shí)不同倍性氣孔密度之間數(shù)據(jù)交叉較多，利用氣孔密度判斷染色體倍性需要數(shù)據(jù)較多，且不夠直觀，誤判率較高。

表3 茶樹(shù)二倍體與四倍體氣孔密度比較Table 3 Comparison of stomata density between diploid and tetraploid tea

由表4所示，對(duì)茶樹(shù)染色體數(shù)目與保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度之間進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間相關(guān)性顯著，相關(guān)系數(shù)為0.185，對(duì)二倍體與四倍體茶樹(shù)的氣孔長(zhǎng)度進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（t檢驗(yàn)），結(jié)果顯示兩者之間差異極顯著，但結(jié)合圖10可以看出兩者數(shù)據(jù)在29～33部分重合交叉，說(shuō)明保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度不能很好地反映茶樹(shù)染色體倍性，無(wú)法作為判斷茶樹(shù)倍性的依據(jù)。

圖9 茶樹(shù)不同倍性植株氣孔密度分布Figure 9 Distribution of stoma density of different ploidy tea plants

由表5所示，對(duì)茶樹(shù)染色體數(shù)目與保衛(wèi)細(xì)胞寬度之間進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間的相關(guān)性是高度顯著的，相關(guān)系數(shù)為0.358，二倍體與四倍體茶樹(shù)的保衛(wèi)細(xì)胞寬度之間差異極顯著，染色體倍性增加致使保衛(wèi)細(xì)胞變寬，說(shuō)明保衛(wèi)細(xì)胞寬度可以作為鑒定染色體倍性的依據(jù)。但結(jié)合圖11可以看出，利用保衛(wèi)細(xì)胞寬度鑒定染色體倍性與氣孔密度鑒定染色體倍性情況相類似，二倍體茶樹(shù)保衛(wèi)細(xì)胞寬度變異較大，變異幅度為17～35，變異系數(shù)達(dá)15.24%，且不同倍性保衛(wèi)細(xì)胞寬度之間交叉較多，利用保衛(wèi)細(xì)胞寬度判斷染色體倍性誤判率會(huì)較高，且需要數(shù)據(jù)較多，不夠直觀。

表5 茶樹(shù)二倍體與四倍體保衛(wèi)細(xì)胞寬度比較Table 5 Comparison of stomata guard cell width between diploid and tetraploid tea

3 討論

3.1 茶樹(shù)腋芽多倍體誘導(dǎo)最佳條件組合研究

目前，化學(xué)誘導(dǎo)多倍體使用最為廣泛的誘導(dǎo)劑為秋水仙素[12]。秋水仙素濃度和處理時(shí)間是影響誘導(dǎo)效果的主要因素[13-15]。不同植物對(duì)秋水仙素的耐受力不同，相同植物不同處理部位多倍體的最佳誘導(dǎo)濃度也不相同。陳士炎[6]用 0.2%～0.5%的秋水仙素處理茶樹(shù)種子48和72 h，獲得了四倍體茶樹(shù)，劉靜等[9]使用0.2%濃度秋水仙素處理1年生實(shí)生苗，發(fā)現(xiàn)其植株和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，本試驗(yàn)設(shè)置了不同的秋水仙素濃度以及時(shí)間，以期為茶樹(shù)腋芽的多倍體誘導(dǎo)提供較可靠的理論依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用0.3%濃度秋水仙素處理4 d可以獲得最高的形態(tài)變異率、多倍體誘導(dǎo)率以及較高的成活率。當(dāng)秋水仙素濃度高于0.3%時(shí)，多倍體變異率降低，這可能是由于秋水仙素濃度過(guò)高，對(duì)茶樹(shù)腋芽的毒害作用增強(qiáng)，此時(shí)雖然誘導(dǎo)效果增強(qiáng)，但是誘導(dǎo)材料大量死亡，從而導(dǎo)致變異材料的存活數(shù)量總體大幅度減少。當(dāng)秋水仙素濃度低于0.3%時(shí)，可能由于秋水仙素濃度太低，不足以抑制紡錘體的形成，從而降低了多倍體誘導(dǎo)效率；處理時(shí)間對(duì)多倍體誘導(dǎo)效果影響顯著，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，茶樹(shù)腋芽的成活率逐漸降低，多倍體的誘導(dǎo)率先增加后降低，在本試驗(yàn)研究的濃度范圍內(nèi)，處理時(shí)間為4～6 d均可以獲得該處理濃度下的最高變異率，這可能是由茶樹(shù)的細(xì)胞代謝周期決定的。

圖10 茶樹(shù)不同倍性植株保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度分布Figure 10 Distribution of guard cell length of different ploidy tea plants

圖11 茶樹(shù)不同倍性植株保衛(wèi)細(xì)胞寬度分布Figure 11 Distribution of guard cell width of different ploidy tea plants

3.2 茶樹(shù)倍性快速鑒定

染色體計(jì)數(shù)法是判斷植物倍性最直觀且常用的方法，但此方法操作過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)耗力，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)類蔬菜、枇杷、苜蓿、煙草、蘋果、梨、棉屬等植物的染色體倍性與氣孔性狀呈一定的相關(guān)關(guān)系，利用氣孔性狀是間接判斷植株倍性的一種簡(jiǎn)便、有效的方法[16-21]。但對(duì)茶樹(shù)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞性狀與染色體倍性關(guān)系的報(bào)道較少[11]。本試驗(yàn)研究了形態(tài)學(xué)、保衛(wèi)細(xì)胞及其葉綠體數(shù)目與茶樹(shù)倍性之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，多倍化新梢與二倍體新梢性狀差距明顯，多數(shù)倍性變異新梢會(huì)出現(xiàn)葉質(zhì)變厚，葉色變綠的性狀，有些則會(huì)發(fā)生葉形或顏色的改變，形態(tài)學(xué)與染色體計(jì)數(shù)法鑒定茶樹(shù)倍性結(jié)果較一致，最佳組合均為0.3%濃度秋水仙素處理4 d，且隨著濃度的升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)，形態(tài)學(xué)變異新梢中倍性增加新梢的比例較高，有些可以達(dá)到100%。氣孔性狀中，葉綠體數(shù)目與茶樹(shù)倍性呈正相關(guān)關(guān)系，兩者之間的比例符合其染色體數(shù)目之比2∶1，這與陳士炎及其他作物的鑒定結(jié)果一致[11，16-18]；氣孔密度與保衛(wèi)細(xì)胞寬度雖然與茶樹(shù)染色體倍性高度相關(guān)，不同倍性之間差異也分別達(dá)到顯著和極顯著水平，但數(shù)據(jù)交叉較多，需要較多的數(shù)據(jù)支撐，在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)造成較多誤判；而二倍體與四倍體茶樹(shù)的氣孔長(zhǎng)度之間差異不顯著，因此，氣孔長(zhǎng)度無(wú)法作為判定茶樹(shù)倍性的指標(biāo)。

綜上所述，在鑒定茶樹(shù)染色體變異時(shí)，可以先通過(guò)形態(tài)觀察進(jìn)行初步篩選，然后采用葉綠體數(shù)目法對(duì)形態(tài)初篩的植株進(jìn)行再次篩選，此種方法方便快捷，準(zhǔn)確率高，可提高工效，對(duì)于加快茶樹(shù)育種進(jìn)程具有重要意義。