銅脅迫對(duì)白三葉和高羊茅混種富集特性及抗性的影響

鄧喬予，劉沛霖，胡建成，胡林容，楊遠(yuǎn)祥

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，成都 611130）

隨著我國(guó)工業(yè)的不斷發(fā)展，電鍍、地磚、銅鋁材等大量重金屬污染型工礦企業(yè)遍布城鄉(xiāng)。工業(yè)“三廢”排放、高銅殺菌劑、殺蟲劑、化肥不合理使用等導(dǎo)致土壤中銅污染日益嚴(yán)重?！度珖?guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》[1]顯示，當(dāng)前我國(guó)土壤生態(tài)環(huán)境狀況十分嚴(yán)峻，16.1%的土壤重金屬污染問(wèn)題突出。從污染類型來(lái)看，主要以無(wú)機(jī)型為主，而重金屬銅超標(biāo)情況在總的無(wú)機(jī)污染物中占到2.1%，因此治理土壤銅污染顯得尤為緊迫。

重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)主要分為工程治理法、化學(xué)治理法、生物治理法3種[2]?；瘜W(xué)和工程治理法在眾多重金屬污染處理中效果較好，但因其處理工藝復(fù)雜，成本較高，且處理后土壤自然性狀易遭到破壞，在實(shí)際應(yīng)用中受到很大限制。而生物治理法主要利用微生物、植物和動(dòng)物進(jìn)行治理，與前2種方法相比，此方法投資少，管理便利且對(duì)環(huán)境破壞性小，受到大量環(huán)境工作者的關(guān)注。利用超富集植物對(duì)土壤進(jìn)行修復(fù)已成為目前研究熱點(diǎn)之一[3]，而植物的選擇則成為植物修復(fù)技術(shù)的重點(diǎn)。自R.R.Brooks提出超富集植物至今，已有700多種超富集植物被發(fā)現(xiàn)[4]，但這些植物大多存在生長(zhǎng)緩慢，生物量低，地上部分生物量較小的問(wèn)題，難以滿足商業(yè)要求[5]。因此選擇耐受能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快速、生物量大的植物運(yùn)用于土壤污染修復(fù)已成為彌補(bǔ)超富集植物缺點(diǎn)的另一個(gè)突破方向。李致穎等[6-7]發(fā)現(xiàn)，豆科白三葉（Trifolium repens）、禾本科高羊茅（Festuca elata）具有生長(zhǎng)迅速、生物量大的特點(diǎn)，兩種植物在銅污染土壤中能正常生長(zhǎng)，可能具有一定的銅污染土壤修復(fù)能力。有研究表明將富集植物進(jìn)行混種可以提高富集植物的重金屬積累量，如將假繁縷（Theligonum macranthum）、三葉草（Trifoliumnpratense）混種后，可提高假繁縷鎘積累量[8]；兩種生態(tài)型三葉鬼針草（Bidens pilosa）混種后，可以有效提高鬼針草對(duì)鎘的積累能力[9]。

豆科、禾本科植物混種群落因具有經(jīng)濟(jì)有效的氮素來(lái)源、良好的土壤水分、養(yǎng)分、光資源調(diào)配能力而引起了研究者們的廣泛關(guān)注[10]。目前對(duì)豆禾植物混種研究多集中在草地生產(chǎn)性能[11]、豆禾混種比例、刈割強(qiáng)度[12]、群落多樣性、群落穩(wěn)定性[13]等方面，而豆禾植物混種對(duì)重金屬的富集特性、抗性等方面鮮有報(bào)道。

本研究采用豆禾混種方式，以白三葉和高羊茅為研究對(duì)象，采用人工控制性盆栽試驗(yàn)，研究不同濃度銅脅迫下白三葉和高羊茅混種植株抗性及富集特性，以期揭示這兩種植物混種對(duì)銅污染土壤的修復(fù)潛力，進(jìn)而為類似植物混種運(yùn)用于重金屬污染土壤修復(fù)研究提供一些參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物：高羊茅選用品種為獵狗5號(hào)（HoundogⅤ），白三葉選用品種為春茵，以上兩種植物草籽均購(gòu)買于成都市溫江區(qū)花卉市場(chǎng)。

供試土壤：采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)試驗(yàn)地，土壤類型為水稻土。將供試土壤風(fēng)干、研磨后過(guò)3目篩，測(cè)定其理化性質(zhì)和重金屬銅的背景值。經(jīng)測(cè)定，土壤有機(jī)質(zhì)為 11.8 g/kg，堿解氮、有效磷、速效鉀、有效銅和全銅分別為 22.7、20.1、161.0、1.89 和10.34 mg/kg，陽(yáng)離子交換量（CEC）為 l8.5 cmol/kg，pH 值為 6.8。

供試重金屬：采用 CuSO4·5H2O（AR），由雅安市瑞進(jìn)特生化試劑門市提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用人工控制性盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)盆口徑為25cm，高度為30 cm，每盆加入土壤7.0 kg。土壤銅污染處理參考王小玲等[14]方法，將土壤Cu2+濃度設(shè)置為 CK（0 mg/kg）、C1（50 mg/kg）、C2（100 mg/kg）、C3（150 mg/kg）、C4（200 mg/kg）、C5（250 mg/kg）、C6（300 mg/kg）等7種處理水平。每種處理3次重復(fù)，共21盆。2016年4月15日將每盆土壤用設(shè)定濃度的銅溶液浸泡，常溫放置穩(wěn)定1個(gè)月后備用。

2016年5月15日開(kāi)始對(duì)試驗(yàn)植物進(jìn)行培養(yǎng)。每盆土壤先加入相同量底肥，底肥P、K含量分別為100、150 mg/kg（以 KH2PO4、KCl的形式加入），N 含量為150 mg/kg（以尿素形式加入）。將高羊茅和白三葉草籽按1∶1混種，待幼苗長(zhǎng)出后，拔除多余幼苗，每盆留下健壯、生長(zhǎng)一致的高羊茅和白三葉幼苗各6株，按常規(guī)管理培養(yǎng)植物80 d。2016年9月2日采集形態(tài)特征幾乎一致且無(wú)病害的白三葉和高羊茅完整植株，然后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

葉綠素含量：分別取收集到的完整植株上倒數(shù)第3、第4片完全成熟葉片，每個(gè)處理混勻后稱取0.5 g，用10 mL 80%的丙酮浸提過(guò)夜，至葉肉組織完全變白時(shí)倒出浸提液，再使用80%的丙酮定容至10 mL。以80%的丙酮為空白對(duì)照，使用UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定浸提液在663、645、470 nm波長(zhǎng)處的光密度值，計(jì)算各光合色素含量[15]。

可溶性糖含量：分別稱取1.0 g高羊茅和白三葉樣品，加入少許石英砂研磨至勻漿，室溫下靜置30 min，過(guò)濾后定容至100 mL，棄去殘?jiān)褂幂焱壬╗16]進(jìn)行測(cè)定。

可溶性蛋白含量：稱取高羊茅和白三葉新鮮葉片各 1.0 g，冰浴研磨前加入 pH 為 7.0 的 0.05 mol/L磷酸緩沖液，待研磨成勻漿后，導(dǎo)入離心管中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min，取上清液作為樣液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行測(cè)定[17]。

重金屬含量：植物樣品分為地上部分和根部?jī)刹糠郑谜麴s水將植物樣品沖洗干凈，使用20 mmol/L乙二胺四乙酸鈉（Na2EDTA）交換15 min，去除表面附著的重金屬離子，并用去離子水洗凈。使用吸水紙將水分吸干后，將植物樣品在105℃下殺青30 min，在75℃下烘干至恒重后，測(cè)定其生物量。將樣品粉碎，過(guò)100目尼龍篩。稱取0.1g植物樣品，加入10mL混酸（優(yōu)級(jí)純硝酸-高氯酸=4∶1），浸泡封口過(guò)夜，次日于電熱板上加熱消煮，直至消煮液澄清透明，用去離子水定容至50 mL，用原子吸收分光光度法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以mg/kg表示[18-19]。

各富集特征指標(biāo)計(jì)算公式為：

植物銅積累量/（mg/kg）=各部分銅含量/各部分生物量

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)TF=地上部銅含量/地下部銅含量

富集系數(shù)BCF=地上（下）部銅含量/土壤銅含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD，P＜0.05）進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，使用Origin9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫對(duì)兩種植物葉綠素的影響

如圖1所示，隨著銅濃度的增加，兩種植株的葉綠素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。白三葉的葉綠素在銅濃度為C3時(shí)葉綠素含量達(dá)到最大值1.75 mg/g，較對(duì)照組高出59%；高羊茅在C2時(shí)葉綠素含量達(dá)到最大值1.85 mg/g，高出對(duì)照組37.04%。當(dāng)處理濃度為C5時(shí)，對(duì)白三葉和高羊茅葉綠素含量的影響較大，其含量分別僅為對(duì)照組的72.72%、55.56%?？梢?jiàn)，兩種植物在銅濃度范圍為CK～C4時(shí)具有良好的耐受性，且低濃度的銅對(duì)兩種植物葉綠素的合成有促進(jìn)作用。

圖1 銅迫對(duì)兩種植物葉綠素含量的影響Figure 1 Effects of Cu stress on Chl content of two plants

2.2 銅脅迫對(duì)兩種植物可溶性糖的影響

從圖2可見(jiàn)，兩種植物的可溶性糖含量隨著銅濃度增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但變化差異不大（P＞0.05）。銅濃度為C1、C2時(shí)的可溶性糖含量與CK并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），銅濃度上升至 C6 時(shí)的可溶性糖含量與濃度為C1處于同一水平，僅僅略低于對(duì)照組水平。因此，環(huán)境中銅的含量處在C1至C6之間時(shí)，對(duì)高羊茅和白三葉混種可溶性糖含量的影響并不大。

圖2 銅脅迫對(duì)兩種植物可溶性糖含量的影響Figure 2 Effects of Cu stress on soluble sugar concentration of two plants

2.3 銅脅迫對(duì)兩種植物可溶性蛋白的影響

由圖3可知，隨著銅濃度的增加，兩種植物的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但差異并不明顯（P＞0.05）。白三葉的可溶性蛋白含量在處理濃度為C1、C2 時(shí)與對(duì)照組 CK 無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；銅濃度為C3、C5時(shí)可溶性蛋白含量也沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。對(duì)于高羊茅，其可溶性蛋白含量在處理濃度C3與C5時(shí)并無(wú)顯著變化（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，銅濃度小于C5時(shí)，對(duì)高羊茅和白三葉可溶性蛋白含量并無(wú)顯著影響（P＞0.05），高羊茅和白三葉的混種能較好地在低濃度銅脅迫下正常生長(zhǎng)。

圖3 銅脅迫對(duì)兩種植物可溶性蛋白含量的影響Figure 3 Effects of Cu stress on soluble protein concentration of two plants

2.4 銅脅迫對(duì)銅積累的影響

由圖4可知，白三葉和高羊茅兩種植物地上部分銅積累量分別為 43.82～414.13 mg/kg，41.60～405.07 mg/kg，地下部分銅積累量分別為 49.75～439.23 mg/kg，43.98～430.50 mg/kg。白三葉地上部分和根部隨著銅含量的增加其銅積累量有顯著的提高（P＜0.05），當(dāng)銅濃度為 C6 時(shí)達(dá)到最大值，分別為414.13 mg/kg 與 439.23 mg/kg。高羊茅的銅積累量也呈現(xiàn)出與白三葉類似的變化規(guī)律，當(dāng)銅的處理濃度達(dá)到C6時(shí)，其地上部分和地下部分的積累量達(dá)到最大值分別為 405.07 mg/kg 與 430.50 mg/kg。

圖4 銅脅迫對(duì)兩種植物重金屬積累的影響Figure 4 Effects of Cu stress on copper content of two plants

2.5 銅脅迫對(duì)富集系數(shù)的影響

如圖5所示，隨著銅濃度增加，兩種植物的地上部分和地下部分都呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)（P＜0.05）。白三葉和高羊茅在銅濃度為C6時(shí)富集系數(shù)達(dá)到最大值，其地上部分富集系數(shù)分別為2.03和1.67，根部富集系數(shù)分別為 2.15 和 1.77。當(dāng)銅濃度為C4時(shí)，白三葉和高羊茅地上部分的富集系數(shù)分別為 1.79、1.44，均大于地下部分，表現(xiàn)出富集植物的特征。

圖5 銅脅迫對(duì)兩種植物富集系數(shù)的影響Figure 5 Effects of Cu stress on bioconcentration factors of two plants

2.6 銅脅迫對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

如圖6所示，當(dāng)銅濃度小于C4，白三葉和高羊茅的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)（P＜0.05），并在C4達(dá)到最大值1.02。此時(shí)兩種植物都達(dá)到了富集植物的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)處理濃度高于C4時(shí)，高羊茅和白三葉的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)逐漸減小，但都接近于1。說(shuō)明當(dāng)生存土壤中的銅濃度沒(méi)有嚴(yán)重影響兩種植物的生理功能時(shí)，其體內(nèi)重金屬由根系轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分的能力較強(qiáng)。

圖6 銅脅迫對(duì)兩種植物轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響Figure 6 Effects of Cu stress on translocation factors of two plants

3 討論

3.1 銅脅迫對(duì)白三葉和高羊茅混種植株抗性的影響

有關(guān)豆禾混種的研究表明，混種可使草地的光合生理生態(tài)特性會(huì)得到改善[20-21]。豆禾混種牧草主要從葉片、根系在空間上分布的差異性來(lái)提高光資源的利用率，并增強(qiáng)植物光合生理過(guò)程[5]。本研究以葉綠素含量的變化為切入點(diǎn)，揭示混種條件對(duì)植物光合生理特性的影響。儲(chǔ)玲等[22-23]的研究結(jié)果顯示，白三葉和高羊茅單種時(shí)，在低濃度銅脅迫（10 mg/L）下能較好生長(zhǎng)，濃度繼續(xù)增高會(huì)使植物的生物量顯著降低，葉片發(fā)黃。而本研究發(fā)現(xiàn)，銅脅迫對(duì)白三葉和高羊茅混種植株的葉綠素含量影響較小，當(dāng)銅濃度達(dá)到250 mg/L時(shí)，葉綠素含量才顯著降低，說(shuō)明混種條件下植物的耐受能力及合成葉綠素的能力相對(duì)于單種有顯著的提高。此外，低濃度的銅（≤100 mg/kg）對(duì)兩種混種植物的葉綠素合成有促進(jìn)作用，這與王艾萍等[24]的研究結(jié)果類似。

過(guò)量的銅會(huì)嚴(yán)重?fù)p害植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜[25]。處于逆境下的細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)可溶性糖含量，來(lái)抵抗外界環(huán)境對(duì)其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的威脅?？扇苄缘鞍踪|(zhì)與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢(shì)有關(guān)，高濃度的可溶性蛋白質(zhì)可幫助維持植物細(xì)胞較低的滲透勢(shì)，抵抗脅迫帶來(lái)的傷害[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著銅濃度的增加，可溶性糖和可溶性蛋白的含量總體呈遞減趨勢(shì)，但銅脅迫處理組下兩種物質(zhì)的含量與CK組并無(wú)顯著差異，說(shuō)明在本研究設(shè)置的銅脅迫濃度范圍內(nèi)，兩種植物能夠較好生長(zhǎng)。

3.2 銅脅迫對(duì)白三葉和高羊茅混種植株銅富集特性的影響

崔爽等[28]的研究表明，普通植物地上部分銅平均積累量為10 mg/kg。本研究發(fā)現(xiàn)，在銅脅迫濃度分別為C1～C6時(shí)，混種方式可使白三葉地上部分銅積累量分別為普通植物的 4、12、15、28、30、41 倍，高羊茅地上部分銅積累量分別為普通植物的4、12、18、27、29、40 倍，表現(xiàn)出富集植物的特征。

混種可以提高超富集植物對(duì)重金屬的吸收，進(jìn)而加強(qiáng)植物的重金屬累積量[29]。趙達(dá)偉[7]的研究表明，當(dāng)土壤中銅濃度上升到100 mg/kg時(shí)，高羊茅和白三葉單種時(shí)地上部分的富集系數(shù)都小于1；當(dāng)土壤中銅濃度上升到400 mg/kg時(shí)，高羊茅和白三葉地下部分的富集系數(shù)小于1；總體來(lái)看，地下部分富集系數(shù)遠(yuǎn)高于地上部分，說(shuō)明大部分的銅滯留在根系中，沒(méi)有向地上部分移動(dòng)，不能通過(guò)收割的方式來(lái)減少土壤重金屬污染。而本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)混種方式能使白三葉地上部分富集系數(shù)得到一定提升，且當(dāng)銅脅迫濃度達(dá)到200 mg/kg時(shí)植株的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)大于1，說(shuō)明兩種植物混種使得白三葉根系重金屬銅向地上部分的轉(zhuǎn)移能力得到提高，兩種植物的混種存在一定協(xié)同作用，使其銅富集能力有了顯著提升。

綜上所述，豆禾混種方式會(huì)影響植物在重金屬脅迫條件下的抗性與富集特性。將高羊茅和白三葉進(jìn)行1∶1混種，可使兩種植物對(duì)銅脅迫的耐受能力、富集能力及轉(zhuǎn)運(yùn)能力得到提高，具有一定現(xiàn)實(shí)意義；另一方面，高羊茅和白三葉作為兩種常見(jiàn)牧草，其生物量大，生長(zhǎng)周期短，克服了超富集植物生物量低、生長(zhǎng)速度慢的缺點(diǎn)。因此，采用高羊茅和白三葉1∶1混種，可望在土壤銅濃度＜250 mg/kg的污染區(qū)作為一種適宜的植物修復(fù)方式。