卵穗山羊草1My亞基特異性分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

鄭 柯，易瀅瑾，趙來(lái)賓，劉冬梅，許 凱，郝 明，張連全，劉登才，甯順腙

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，成都 611130）

小麥高分子量谷蛋白占胚乳總蛋白含量的10%左右[1]，盡管含量較少，但對(duì)小麥面粉加工品質(zhì)有非常重要的作用。小麥高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）由位于第一同源群染色體長(zhǎng)臂上的Glu-1位點(diǎn)編碼[2]。每個(gè)Glu-1位點(diǎn)包含2個(gè)緊密連鎖的基因，分別編碼一個(gè)分子量較大的x-型亞基和一個(gè)分子量較小的y-型亞基[3]。HMW-GS種類和數(shù)量均影響小麥的加工品質(zhì)。近年來(lái)，人們的生活水平逐漸提高，對(duì)小麥品質(zhì)有了更高的要求。小麥HMW-GS遺傳位點(diǎn)的遺傳基礎(chǔ)較窄，阻礙了小麥品質(zhì)的改良[4]，向小麥轉(zhuǎn)移新的HMW-GS顯得尤為重要。

卵穗山羊草（Aegilops ovata L.，U°U°M°M°，2n=4x=28）是小麥遺傳改良的重要基因源，其中U°來(lái)自小傘山羊草（Ae.umbellulata，2n=2x=14，UU），M°來(lái)自頂芒山羊草（Ae.comosa，2n=2x=14，MM）。卵穗山羊草分布很廣，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，中東以及俄羅斯和烏克蘭的南部，具有抗旱、抗逆、耐瘠薄及高抗白粉病和條銹病等優(yōu)點(diǎn)[5]。G.Monika[6]通過(guò)分析1Mg（1A），1Mg（1B）和1Mg（1D）代換系，表明Glu-Mg1可以提高小麥品質(zhì)，其中1Mg（1A）代換系的效應(yīng)最強(qiáng)。

SDS-PAGE是小麥高分子量谷蛋白最常用的鑒定方法，需要的設(shè)備以及試劑相對(duì)簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀；但分辨率較低，對(duì)分子量差異小的亞基難以區(qū)分。因此基于等位基因之間的DNA序列多態(tài)性，開(kāi)發(fā)特異分子標(biāo)記，具有選擇快速、準(zhǔn)確、成本低的特性，已成為追蹤鑒定HMW-GS的重要技術(shù)手段。許多HMW-GS已開(kāi)發(fā)有特異性分子標(biāo)記，如1Dx5[7-8]、1Ax2[8]、1Bx7[9]、1Bx14 和 1Bx17[10]、1By18[11]、Glu-1Ssh[12]等。

1Mx和1My特異性分子標(biāo)記有利于在轉(zhuǎn)移其到小麥背景中的追蹤鑒定，加速其在小麥品質(zhì)遺傳改良中的應(yīng)用。本試驗(yàn)通過(guò)分析1My與1A、1B、1D、1U°、1M°染色體部分高分子量谷蛋白亞基編碼基因序列，設(shè)計(jì)1My亞基特異性分子標(biāo)記，以期為篩選含有1My小麥育種提供便利。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

卵穗山羊草（Aegilops ovata L.，U°U°M°M°，2n=4x=28）AS6，普通小麥異源2號(hào)和川麥41，卵穗山羊草-小麥1M°附加系（簡(jiǎn)稱附加系）11份與其不含有1M°染色體的姊妹系（簡(jiǎn)稱姊妹系）9份，為AS6/2/異源2號(hào)//川麥41 F7中篩選獲得（未發(fā)表），48個(gè)普通小麥品種（系），普通小麥中國(guó)春作為SDS-PAGE對(duì)照材料。以上材料均保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥所。所有材料的HMW-GS組成見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)材料及高分子量谷蛋白亞基組成Table 1 Experiment materials and their HWM-GS compositions

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SDS-PAGE 分析

種子蛋白提取和SDS-PAGE分析參照Yan Z.等[13]的方法。采用不連續(xù)分離系統(tǒng)進(jìn)行電泳，電泳檢測(cè)時(shí)，取谷蛋白液3 μL點(diǎn)樣。SDS-PAGE電泳條件為電壓120 V，電流20 mA。電泳2 h 10 min后用染色液染色1 h，使用蒸餾水脫色，背景清晰后照相保存。亞基命名按照P.I.Payne[14]命名系統(tǒng)。

1.2.2 分子標(biāo)記設(shè)計(jì)

參考Wei L.等[12]的方法，利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）上登錄的HMW-GS編碼基因序列，用 DNAMAN7（Lynnon Biosoft，USA）進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)合手動(dòng)調(diào)整，分析其序列之間的SNPs差異，設(shè)計(jì)1My特異性分子標(biāo)記。

1.2.3 目標(biāo)序列的克隆測(cè)序

采用CTAB法提取新鮮葉片的DNA[15]。用分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，用1.0%瓊脂糖進(jìn)行電泳鑒定，獲得的目標(biāo)片段使用瓊脂糖回收試劑盒（OMEGA，USA）回收，然后將目標(biāo)片段用pMD19-T Vector Cloning Kit（Takara，Japan）進(jìn)行連接，連接體系為：pMD19-T 載體 0.5 μL，SolutionⅠ4.5 μL，回收DNA產(chǎn)物100 ng，加入ddH2O至10 μL。反應(yīng)液在16℃連接4 h，然后轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)大腸桿菌。每個(gè)材料獲得的陽(yáng)性克隆選取3個(gè)以上送上海生工生物工程股份有限公司（Sangon Biotech，China）進(jìn)行測(cè)序，序列比對(duì)在NCBI的BLAST中進(jìn)行，多序列比對(duì)在 DNAMAN7（Lynnon Biosoft，USA）中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)材料HMW-GS表達(dá)情況

卵穗山羊草AS6有4個(gè)HMW-GS表達(dá)（圖1），從上到下分別是 1Ux，1Mx，1Uy 和 1My[6]。1Ux 遷移率最小，小于1Dx2；1Mx與1Dx2具有相似或略小的遷移率；1Uy介于1Bx7和1Dx2之間，遷移率稍小于1Bx7；1My介于1By8和1Dy12之間，遷移率稍小于1Dy12。附加系含有一條與親本AS6的1My具有相似遷移率的條帶（圖1箭頭處），而姊妹系和普通小麥親本異源2號(hào)和川麥41則沒(méi)有這一條帶。

圖1 SDS-PAGE分析Figure 1 SDS-PAGE analysis

2.2 1My分子標(biāo)記設(shè)計(jì)

下載 NCBI上收錄的 1My（Genbank：KX375405.1）、1Dx2（Genbank：KF466259.1）、1Dy3（Genbank：KF466 260.1）、1Ax（Genbank：JQ007589.1）、1Bx13（Genbank：EF540764.1）、1Dy11（Genbank：EU528008.1）、1By16（Genbank：EF540765.1）、1Ay（Genbank：MF098417.1）、1Mx（Genbank：KX375404.1）、1Uy（Genbank：KX3754 07.1）和 1Ux（Genbank：KX375406.1）基因序列，用DNAMAN7進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)1My特異的SNP位點(diǎn)（圖2）。利用這2個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR分子標(biāo)記，上引物：5’-CGTGGCTCTCACCGTC GCTC-3’，下引物：5’-AAGATGTTACGCTTGGGTA G-3’。

圖2 1My特異SNPsFigure 2 1My specific SNPs

2.3 1My亞基特異性分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增和驗(yàn)證

用設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記對(duì)附加系、姊妹系、親本材料以及品種（系）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：2×Taq Plus Master Mix（Vazyme，China）12.5 μL，上下引物（10 μM）各 1 μL，模板 DNA 50～100 ng，加入ddH2O至25 μL。PCR程序：94℃預(yù)熱5 min，94℃變性 30 s，63 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，共 30個(gè)循環(huán)，最后72℃總延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

與預(yù)期分析一致，除AS6和附加系材料均擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度位于250 bp和500 bp之間的明亮條帶，普通小麥親本、姊妹系（圖3）以及48個(gè)品種（系）材料均沒(méi)有擴(kuò)增出條帶。

為進(jìn)一步驗(yàn)證AS6和附加系擴(kuò)增序列來(lái)自于1My編碼基因，將AS6和附加系中擴(kuò)增出的片段進(jìn)行克隆測(cè)序，分別獲得了一條356 bp的序列。這2條序列完全一致，且與1My參考序列（Genbank：KX375405.1）在匹配區(qū)域完全相同。

圖3 1My特異性分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增Figure 3 PCR amplification of 1My specific molecular marker

3 討論與結(jié)論

通過(guò)開(kāi)發(fā)和利用分子標(biāo)記輔助選擇，可以快速準(zhǔn)確篩選目的基因，使得大量的材料可以在短時(shí)間內(nèi)完成篩選，以節(jié)約時(shí)間和資源[8]。以目前的研究水平，小麥的品質(zhì)無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單的形態(tài)指標(biāo)來(lái)進(jìn)行鑒定。P.I.Payne等[2]通過(guò) SDS-PAGE 將不同 HMW-GS分離，建立了HMW-GS品質(zhì)評(píng)分系統(tǒng)，顯示了不同亞基對(duì)品質(zhì)的貢獻(xiàn)不同。Glu-B1和Glu-D1位點(diǎn)的亞基對(duì)面團(tuán)的強(qiáng)度影響顯著[16-17]。1Dx5+1Dy10、1Bx7+1By8等被認(rèn)為是優(yōu)異的面包小麥亞基組合[18]。同時(shí)，近緣屬種也是小麥多樣化谷蛋白亞基的重要供體，如西爾斯山羊草（Aegilops searsii）1SS可以提高籽粒蛋白質(zhì)的含量，質(zhì)量以及面團(tuán)強(qiáng)度[19]；高大山羊草（Aegilops longissima）1Sl的 HMW-GS 1S1x2.3*和1S1y16*，可以顯著提高成熟種子中谷蛋白的含量[20]；中間偃麥草的Glu-1St#2x可以提高普通小麥的蛋白質(zhì)含量、十二烷基硫酸鈉沉淀值、溶劑保持力[21]。因而，將不同的亞基組合在一起可以滿足小麥品質(zhì)多樣化的需求[22]；但是HMW-GS在SDS-PAGE中的遷移率并不總是與其實(shí)際的分子量一致，這種現(xiàn)象會(huì)對(duì)育種家產(chǎn)生誤導(dǎo)[23]，因此分子標(biāo)記輔助選擇可以避免SDS-PAGE的缺點(diǎn)。本研究設(shè)計(jì)分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果相一致，可以用來(lái)篩選含有1My的材料。

SNPs是有效的第三代分子標(biāo)記和一個(gè)強(qiáng)大的輔助育種的標(biāo)記[24]。不同HMW-GS的C-端非重復(fù)區(qū)和N-端非重復(fù)區(qū)高度保守[9]，主要差異存在于中央重復(fù)區(qū)[25]。本研究通過(guò)比對(duì)已公布的1My亞基編碼基因序列與7個(gè)普通小麥谷蛋白亞基和外源1Mx、1Ux及1Uy編碼基因序列，在1My編碼基因的重復(fù)區(qū)發(fā)現(xiàn)2個(gè)特異的SNP，據(jù)此成功開(kāi)發(fā)了一個(gè)1My特異性分子標(biāo)記。該分子標(biāo)記在48個(gè)普通小麥品種（系）、親本以及不含有1My的姊妹系中無(wú)法擴(kuò)增出條帶，而在卵穗山羊草親本及1M°附加系中均擴(kuò)增出了一條明亮的條帶，通過(guò)克隆該片段并測(cè)序確定其來(lái)自于1My。包含設(shè)計(jì)該分子標(biāo)記時(shí)使用的參考谷蛋白亞基在內(nèi)，該標(biāo)記可能至少在18種高分子谷蛋白亞基的背景中能夠用于鑒定是否含有1My，具有普遍適用性。同時(shí)由于谷蛋白x和y型亞基因緊密連鎖，該標(biāo)記也可以用于篩選含有1Mx的材料。