視黃醇結合蛋白測定試劑盒產(chǎn)品技術審評要點

胡燕嫻 潘瑩 季芳 郭嘉杰 許廣寧 蘇永梅 孫晉紅 康濤 邵秀穩(wěn) 廣東省藥品監(jiān)督管理局審評認證中心 （廣東廣州 510080）

內容提要：視黃醇結合蛋白測定試劑盒體外定量測定人體樣本中視黃醇結合蛋白的含量，臨床上主要用于肝臟或腎小管損傷性疾病的輔助診斷。基于《體外診斷試劑注冊管理辦法》及標準體系等法規(guī)指南文件的要求，文章分析該產(chǎn)品在技術審評過程中應關注的要點，以期幫助注冊申請人更好地把握注冊申報的要求。

視黃醇結合蛋白（Retinol Binding Protein，RBP）為一種小分子蛋白質，是維生素A及其衍生物的特異轉運蛋白，分子量僅為21kD。RBP由肝臟合成，廣泛分布于血清、尿液、腦脊液及其他體液中。在血液中，RBP與視黃醇、前白蛋白以1:1:1（mol）的復合物形式存在，轉運體內90%的視黃醇至身體組織，當RBP與細胞表面的RBP受體結合時，視黃醇進入細胞內，復合物解體，游離的RBP（＜10%）由于可自由通過腎小球膜[1]。但原尿中99%的RBP被近曲小管上皮細胞重攝取并分解供組織利用，僅微量從尿液排泄。正是由于腎小球的重吸收作用，患者尿液中RBP濃度升高，提示近端腎小管損傷或功能受損，有助于腎臟疾病的輔助診斷[2]。近年來，RBP檢測及臨床應用日益受到關注，檢測血和尿液中RBP的濃度，對腎臟、肝臟及營養(yǎng)狀況等疾病的診斷和治療有著重要意義[1,3,4]。

臨床檢測RBP的方法較多，如免疫比濁法、免疫電泳法、酶聯(lián)免疫吸附法和放射免疫分析法等，其中，免疫比濁法因其測定方法快速簡便、自動化程度高在臨床上廣泛應用[1]?；凇扼w外診斷試劑注冊管理辦法》及標準體系等法規(guī)指南文件的要求，本文總結分析了視黃醇結合蛋白測定試劑盒（免疫比濁法）注冊申報中相關重要技術文件的審評要點。

1.適用范圍

本文所述試劑盒是指適用于分光光度計或生化分析儀用免疫比濁法（如免疫透射比濁法、免散射比濁法、膠乳增強免疫比濁法等）測定血清和/或尿液樣本中RBP的試劑盒。根據(jù)《6840體外診斷試劑分類子目錄（2013版）》，視黃醇結合蛋白檢測試劑的管理類別為二類，分類代碼為6840。

2.檢驗原理與產(chǎn)品命名

2.1 檢驗原理

利用免疫比濁法測定RBP時，應區(qū)分散射法和透射法。適量的抗人RBP多或單克隆抗體與樣本中RBP通過抗原-抗體反應特異性結合，形成不溶性免疫復合物微粒，使反應液濁度改變，在一定條件下（如570nm波長處），濁度的高低與免疫復合物微粒數(shù)即RBP含量呈正相關，可由同樣處理的校準品所作的劑量—反應曲線算出。

膠乳增強免疫比濁法即是將待測物質相對應的抗體包被在高分子膠乳顆粒上，當包被有抗體的膠乳顆粒與抗原后，在短時間內迅速聚集在一起，光通過之后，透射光和散射光的強度變化更為顯著，從而提高檢測的敏感性。

2.2 產(chǎn)品命名

產(chǎn)品通用名稱由三部分組成：被測物名稱、用途、方法或原理，名稱中不應當出現(xiàn)樣本類型及定量等內容。根據(jù)不同檢測原理，產(chǎn)品命名舉例為“視黃醇結合蛋白測定試劑盒（免疫透射比濁法）”“視黃醇結合蛋白測定試劑盒（膠乳增強免疫比濁法）”等。

3.產(chǎn)品技術要求

根據(jù)《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術要求編寫指導原則》的要求，對于體外診斷試劑產(chǎn)品，檢驗方法中還應明確采用的參考品/標準品及樣本的制備方法、使用的試劑批次和數(shù)量、試驗次數(shù)、計算方法。性能指標不應低于行業(yè)標準YY/T 1584-2018《視黃醇結合蛋白測定試劑盒（免疫比濁法）》的要求。測定血清、尿液的RBP試劑盒的性能指標及檢驗方法不完全相同，技術要求應結合適用的樣本類型進行制定。為保證企業(yè)制定的技術要求檢驗方法具有可重現(xiàn)性和可操作性，下面對行業(yè)標準中未做明確規(guī)定的條款或檢驗方法進行細化和補充。

3.1 試劑空白吸光度

檢測方法明確具體測試次數(shù)，若多次測試，則均值為空白吸光度，同時明確空白樣本為純化水或生理鹽水或零校準液等?？瞻孜舛葢掀髽I(yè)規(guī)定的要求，可參考已上市同類產(chǎn)品進行制定。

3.2 準確度

采用相對偏差法評價準確度時，應考慮有證參考物質或其他公認的參考物質的選擇。有證參考物質（CRM）是指附有證書的參考物質，其一種或多種特性值用建立了溯源性的程序確定，使之可溯源到準確復現(xiàn)的表示該特性值的測量單位，每一種出證的特性值都附有給定置信水平的不確定度[5]。國際約定校準品/參考物質、國家標準品/參考物質通常附有證書，可被定義為有證參考物質。

3.3 線性

線性下限原則上不應為零，至少大于空白吸光度對應的濃度，不小于檢出限（LoD）或定量限（LoQ）。檢測方法應明確具體的濃度個數(shù)，濃度涵蓋線性范圍，配制適當?shù)臐舛赛c，低濃度樣本不宜為零濃度樣本（如稀釋液）。

3.4 校準品或質控品（如有）

如試劑盒注冊單元中包含校準品或質控品，其性能指標的檢驗方法應在技術要求中予以描述。至少應包括外觀、裝量、準確性、均勻性、穩(wěn)定性。干粉或凍干品應包含批內瓶間差、復溶穩(wěn)定性。

樣本背景信息應清晰，樣本來源應可追溯。選擇涵蓋預期用途和干擾因素（如高脂、溶血、黃疸的樣本、類風濕因

4.參考區(qū)間確定資料

應當詳細說明參考區(qū)間確定所采用的樣本來源、確定方法或依據(jù)及詳細的試驗資料。據(jù)報道，血清RBP參考值為25～70mg/L，尿液為0.7mg/L以下，不同樣本之間的參考區(qū)間明顯不同，應分別建立參考區(qū)間，研究各樣本例數(shù)不低于120例[2]。建議參考CLSI EP28-A3c《Defining，Establishing，and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory》或WS/T 402-2012《臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定》進行相應研究。

5.臨床評價資料

視黃醇結合蛋白測定試劑盒屬于《免于進行臨床試驗的體外診斷試劑目錄（修訂）》，申請人可依照《免于進行臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價資料基本要求（試行）》開展評價。如無法或不適于按照上述要求對產(chǎn)品進行臨床評價，則應按照《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求開展臨床試驗。下面僅對臨床評價中的基本問題進行闡述。

5.1 研究方法

檢測RBP目前沒有公認的參考方法，臨床評價時可選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用待評價體外診斷試劑（以下稱考核試劑）與之進行比較研究試驗，證明兩者具有等效性。

5.2 對比試劑的選擇

選擇對比試劑時，應充分了解對比試劑的技術信息，包括方法學、臨床預期用途、主要性能指標、校準品的溯源情況、參考區(qū)間等，提供已上市產(chǎn)品的境內注冊信息及說明書。應盡量選擇方法學相同，線性范圍、精密度、參考區(qū)間等性能接近的同類產(chǎn)品作為對比試劑?？己嗽噭┑臉颖绢愋蛻怀^對比試劑。

5.3 試驗方法

試驗方法可參考有關方法學比對的技術指導文件（如：《體外診斷試劑分析性能評估（準確度-方法學比對）技術審查指導原則》）?？己嗽噭┖蛯Ρ仍噭叫胁僮?，試驗操作的過程中采用盲法。試驗前應設定臨床評價性能指標的可接受標準，如果比較研究試驗結果無法達到預設標準，則考慮適當擴大樣本量進行評價。擴大樣本量和延長試驗時間將提高試驗的可靠性，建議本產(chǎn)品試驗檢測周期至少5d。

5.4 樣本要求

子陽性等）的樣本進行評價研究，充分考慮試驗人群選擇、疾病選擇等內容，考慮到年齡、性別的差異，盡量覆蓋各類適用人群。樣本濃度應注重醫(yī)學決定水平量值/參考區(qū)間臨界值附近樣本的選擇，并涵蓋檢測范圍，盡可能均勻分布。

5.5 樣本量的確定

樣本量應采用合理的統(tǒng)計學方法進行計算，應符合統(tǒng)計學要求?？蛇x擇總樣本量不少于40例并分別采用考核試劑和對比試劑進行雙份測定的方式，其中參考區(qū)間以外樣本應不少于50%。亦可選擇總樣本量不少于100例并分別采用考核試劑和對比試劑進行單次測定的方式。

5.6 統(tǒng)計分析

首先進行離群值觀察，離群值的個數(shù)不得超過限值（2.5%）。任一樣本，如其兩種方法測試的絕對差值/相對差值超所有樣本兩種方法測試絕對差值/相對差值的均值的4倍，則被判斷為離群值[6]。

對臨床試驗結果的統(tǒng)計應結合臨床試驗數(shù)據(jù)的正/偏態(tài)分布情況選擇合適的統(tǒng)計方法。建議給出每個樣本考核試劑對比試劑之間的測定值、差值（偏差）及比值（偏差）散點圖。觀察數(shù)據(jù)分布的均勻性，對兩組檢測結果進行相關、線性回歸及Bland-Altman分析，定量值結果應無統(tǒng)計學差異。回歸分析一般包括：①以y=a+bx和R2的形式給出回歸分析的擬合方程，其中：y是考核試劑結果，x是對比試劑結果，b是方程斜率，a是y軸截距，R2是判定系數(shù)，同時應給出b的95%（或99%）置信區(qū)間。②計算醫(yī)學決定水平的預期偏倚及其95%置信區(qū)間。

5.7 不同樣本

RBP測定試劑盒適用樣本類型為血清和尿液時，兩種樣本不具有可比性，應分別進行符合統(tǒng)計學意義數(shù)量（參考“5.5樣本量的確定”）的評估?？紤]到對血清和尿液的檢測結果可能存在一定差異，故建議對兩種樣本分別進行統(tǒng)計分析，以對考核試劑的臨床性能進行綜合分析。

6.小結

目前，已上市的RBP測定試劑盒主要通過免疫比濁法測定血清和/或尿液中RBP的含量。分析該產(chǎn)品的注冊審評要點，有助于指導企業(yè)的注冊申報工作，同時可為設計開發(fā)同類方法學的其他試劑盒帶來啟示。當試劑盒適用樣本類型不具有可比性時，又無對應產(chǎn)品的指導原則或行業(yè)標準的情況下：①需要從技術要求、參考區(qū)間與臨床評價等方面考慮樣本基質對檢測結果的影響；②性能指標中分析靈敏度及重復性用樣本濃度選擇建議參考醫(yī)學決定水平及參考區(qū)間臨界值，至少選擇正常值和異常值水平兩個濃度。特別需要說明的是，生產(chǎn)企業(yè)應關注相關法律法規(guī)、國家/行業(yè)標準等文件的時效性。