轉(zhuǎn)錄組測序的發(fā)展和應(yīng)用

王楚彪，盧萬鴻，林彥，羅建中

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轉(zhuǎn)錄組測序的發(fā)展和應(yīng)用

王楚彪1,2，盧萬鴻1，林彥1，羅建中1＊

(1.國家林業(yè)和草原局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022；2.南京林業(yè)大學，江蘇 南京 2100037)

轉(zhuǎn)錄組學研究是近年來分子生物學研究的熱門，而轉(zhuǎn)錄組測序是其核心技術(shù)。分子測序技術(shù)經(jīng)歷了第一代到第三代的發(fā)展，取得長足進步，通量和準確性不斷提高，現(xiàn)在應(yīng)用最廣的是二代測序技術(shù)，它主要有Roche/454、ABI/Solid、Illumina/Solexa三種測序平臺，各有利弊。轉(zhuǎn)錄組測序歷經(jīng)基因芯片技術(shù)、基因表達系列分析技術(shù)、大規(guī)模平行測序技術(shù)和RNA-Seq技術(shù)，目前最活躍的RNA-Seq技術(shù)是基于二代測序技術(shù)。轉(zhuǎn)錄組測序的應(yīng)用在基因表達水平分析和差異表達分析、新基因的挖掘、尋找單核苷酸多態(tài)性及應(yīng)用、基因功能注釋都有所體現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄組測序和應(yīng)用是活躍的研究課題，將迅速發(fā)展，并在生物研究中起到愈發(fā)重要的作用。

轉(zhuǎn)錄組；測序技術(shù)；高通量；RNA-Seq

在人類基因組計劃完成后，進入了探究生物奧秘的后基因時代。基因組學、蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學等逐漸得以應(yīng)用，由于轉(zhuǎn)錄組學研究能相對較快得到結(jié)果、容易入手，故迅速發(fā)展起來[1]。轉(zhuǎn)錄組，通常有廣義和狹義之分。廣義轉(zhuǎn)錄組：指生物體的細胞或組織在一個特定狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括不編碼蛋白質(zhì)的RNA(包括tRNA，rRNA， micro RNA等)和能編碼蛋白質(zhì)的信使RNA(mRNA)[2]；狹義轉(zhuǎn)錄組：單指所有信使RNA(mRNA)的總和[3]。轉(zhuǎn)錄組的研究有其重要的作用，是基因結(jié)構(gòu)、功能和基因表達的重要研究手段，也是表型關(guān)聯(lián)研究的重要方法。轉(zhuǎn)錄組學研究迅猛發(fā)展，并已應(yīng)用在醫(yī)學、動物、植物等領(lǐng)域應(yīng)用，其研究的重點是對轉(zhuǎn)錄組的測序和分析。轉(zhuǎn)錄組學和基因組學比較而言，研究范圍更小，針對性更強，因其僅研究被轉(zhuǎn)錄的基因[4]。而轉(zhuǎn)錄組測序是轉(zhuǎn)錄組學研究的關(guān)鍵技術(shù)，正是由于轉(zhuǎn)錄組測試技術(shù)的迅猛發(fā)展，推動了轉(zhuǎn)錄組學研究進入快車道。

1 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的起步和發(fā)展

1.1 高通量測序技術(shù)的發(fā)展歷程

1.1.1 第一代測序技術(shù)

DNA測序技術(shù)是分子生物學研究的基礎(chǔ)和重要技術(shù)，它的發(fā)展經(jīng)歷了幾個重要階段。早在1975年，研究人員就發(fā)明了加減法用于測定DNA序列[5]。兩年后，他們對原有測序方法進行改良，引入了雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，從而得到了雙脫氧鏈終止法(即Sanger測序法)，這很好地提高了DNA序列測定的效率與準確性[6]。同年，MAXAM等[7]報道了通過化學降解以測定DNA序列的方法。以雙脫氧鏈終止法和化學降解法為基礎(chǔ)建立起來的DNA測序技術(shù)，稱為第一代測序技術(shù)。第一代測序技術(shù)的優(yōu)點是讀長長、精度高，至今仍局部應(yīng)用于序列的重測序、突變位點的檢測等相關(guān)研究當中。但是，隨著研究的深入和需求的增長，第一代測序方法存在通量小、成本高等方面的缺陷，已經(jīng)不能滿足深度、高通量測序、基因組測序等大規(guī)模的測序需求，其應(yīng)用前景受到了明顯的制約[8]。

1.1.2 第二代測序技術(shù)

2005年，454生命科學公司(之后被Roche公司收購)首先推出了第二代測序平臺Genome Sequencer 20，它是基于焦磷酸測序的，并測定了支原體的基因組序列，打開了第二代測序技術(shù)的序幕[9]。很快美國Illumina公司推出了Genome Analyzer測序平臺[10]，ABI公司推出SOLID測序平臺[11]，多平臺的推出標志著新測序時代的到來。新一代測序技術(shù)主要特點是測序時間和成本大幅下降、測序通量大幅提高[12]，該技術(shù)又稱作深度測序技術(shù)，是一次革命性變革。該測序技術(shù)目前仍然廣泛應(yīng)用于各行業(yè)的測序和研究。

邊合成邊測序(sequencing by synthesis, SBS)是第二代測序技術(shù)的中心思想之一，例如Illumina公司的的測序方法，先是將目標DNA打碎成約100 ~ 200個堿基小片段，并在片段兩端加上特定的接頭序列，構(gòu)建成為測序文庫，之后將要測序的單鏈的DNA堿基片段利用接頭與芯片表面引物進行互補配對，令其一端固定在該芯片上，而另一端和其他引物進行互補固定，構(gòu)造橋狀結(jié)構(gòu)。通過約30輪的擴增反應(yīng)，每個芯片表面會形成若干億單克隆DNA簇[8]。接下來，加入4種帶有不同顏色熒光標記的dNTP和DNA聚合酶。在DNA合成時，帶有熒光標記的核苷酸在引物末端配對時都會釋放焦磷酸鹽，令熒光標記蛋白放出熒光。之后利用激光掃描反應(yīng)板來獲取各個核苷酸聚合時的熒光顏色，這就能轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的核苷酸序列。重復(fù)這個過程，使得每條模板DNA全部聚合為雙鏈。對所有的熒光信號進行統(tǒng)計，可獲得各個DNA小片段的序列[8]。

二代測序的3種測序平臺各有優(yōu)缺點，見表1。

表1 不同二代測序平臺的比較[12]

注：*成本會有所變化。

Illumina公司的優(yōu)點是測序性價比最高，其運行成本低，測相同數(shù)據(jù)量，成本約為454測序的1/10，機器售價也低，缺點是測序片段短。早期的Illumina測序技術(shù)只有測序讀長20 ~ 30 bp時能保證較高正確率，隨著技術(shù)的進步，目前高質(zhì)量的測序讀長能達到2 × 150 bp或以上。該公司的Hiseq 4000一次運行能產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量達到150 G。

454 FLX的的優(yōu)勢是測序片段長，能獲得讀長達400 bp的高質(zhì)量序列。2008年，該公司全新GS FLX Titanium系列試劑和軟件，使測序通量提高了5倍，一次測序可測得萬條讀長，數(shù)據(jù)總量約500 M。

SOLID測序的測序讀長比較短，然而優(yōu)點是準確度高，測序數(shù)據(jù)的準確度大于99.94%，在15 X覆蓋率的情況下準確度可達到99.99%，是所有公司測序技術(shù)中準確度最高的[13]。

1.1.3 第三代測序技術(shù)

二代測序技術(shù)通量高，成本低，但存在讀長短的問題，使測序后的分析存在不少困難。因此，以單分子測序為特點的第三代測序技術(shù)，也開始逐漸進入人們的視野當中。目前主流的三代測序技術(shù)有Helico BioScience公司的HeliScope技術(shù)[14]；Pacific Bioscience公司的SMRT技術(shù)[15]等。目前三代測序技術(shù)不夠完善，因為單分子的熒光信號較弱，單堿基檢測的準確率也較低，應(yīng)用還不廣泛。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展

轉(zhuǎn)錄組包括一個細胞的所有轉(zhuǎn)錄本信息，是指特定細胞在特定功能狀態(tài)下全部表達基因的總和，而通常所說的轉(zhuǎn)錄組學研究主要是mRNA。轉(zhuǎn)錄組測序和分析可以用于發(fā)現(xiàn)低豐度轉(zhuǎn)錄本、尋找多態(tài)性標記、深度挖掘新基因、繪制轉(zhuǎn)錄圖譜、鑒定基因家族、調(diào)控可變剪切、確定代謝途徑以及進化分析等研究[16]，尤其是分子生物學進入應(yīng)用階段的今天，轉(zhuǎn)錄組學顯得尤為重要。轉(zhuǎn)錄組測序的方法有：基因芯片技術(shù)(Microarray)[17]，基因表達系列分析技術(shù)(SAGE)[18]，大規(guī)模平行測序技術(shù)(MPSS)[19]以及RNA測序技術(shù)(RNA-Seq)[20]。其中RNA-Seq技術(shù)有著高通量、高重復(fù)性、寬檢測范圍、準定量等優(yōu)點，而且其應(yīng)用不局限于已知基因組序列信息的物種，對于未知基因組序列的物種也能夠使用，是其最大的優(yōu)勢[21]。

1.2.1 基因芯片技術(shù)

在“人類基因組計劃”進行中，基因芯片技術(shù)迅速發(fā)展和廣泛被應(yīng)用，是當時功能基因組學研究最重要的研究手段之一。1991年Affymetrix公司在核酸雜交的基礎(chǔ)上開發(fā)世界上第一塊寡核苷酸基因芯片[22]。經(jīng)過多年的發(fā)展，基因芯片技術(shù)比較成熟，提高了分析速度，減少了實驗所需樣品和試劑，實驗技術(shù)及后期數(shù)據(jù)分析都是相當成熟，也形成了龐大的公共數(shù)據(jù)庫。缺點一是芯片上探針的信息決定了基因芯片的檢測范圍，該技術(shù)只適用于檢測已知序列的情況而沒有探索新基因的作用，二是其雜交技術(shù)靈敏度不高，很難檢測到低豐度基因或捕捉到基因表達水平的細小變化[23]。

1.2.2 基因表達系列分析技術(shù)(SAGE)

SAGE技術(shù)的技術(shù)流程是使用錨定酶切開雙鏈并連接相應(yīng)的接頭，后利用標簽酶酶切取得SAGE標簽并進行擴增，再將接頭序列使用錨定酶切除，獲得含標簽二聚體的多聚體并對其測序[24]。SAGE技術(shù)是以前文提到的Sanger測序為基礎(chǔ)的，優(yōu)點是能很快獲得轉(zhuǎn)錄圖譜。

1.2.3 大規(guī)模平行測序技術(shù)(MPSS)

對SAGE技術(shù)的改進形成了MPSS測序技術(shù)。MPSS技術(shù)首先將cDNA克隆到具有不同接頭的載體庫中，再利用PCR擴增載體庫中各個cDNA片段，然后利用聚合酶和dGTP的共同作用將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成單鏈文庫，最后通過雜交將其結(jié)合在帶有Anti-adaptor的微載體上并進行測序。MPSS技術(shù)能在較短時間內(nèi)檢測組織或細胞內(nèi)全部基因的表達情況，在功能基因組研究方面是有效的工具之一[25]。

1.2.4 RNA測序技術(shù)(RNA-Seq)

RNA-Seq是近年發(fā)展起來也是使用最廣泛的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，具有很多優(yōu)點。一是高分辨率，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以準確分辨出單個堿基，同時由熒光模擬信號所引起的背景噪音、交叉反應(yīng)等問題能夠有效地避免；二是高通量，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)不僅能夠得到數(shù)以億計個堿基序列，基本能夠達到覆蓋整個轉(zhuǎn)錄組的要求；三是高靈敏度，目標細胞中低至幾個拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本利用該測序技術(shù)也能檢測到；四是使用更便捷，該技術(shù)能對物種的全轉(zhuǎn)錄組進行分析，不需要在測序前設(shè)計特異性探針，而是直接分析物種的全轉(zhuǎn)錄組[26-28]。

RNA-Seq測序的步驟如下：首先利用純化的mRNA反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA片段文庫，目標mRNA被隨機打斷并反轉(zhuǎn)錄成cDNA或者先進行反轉(zhuǎn)錄后再隨機打斷，之后在文庫各片段兩端加上測序接頭，進行高通量測序。由于測序方法的不同，得到的讀長為30 ~ 400 bp。最后，將這些讀段比對到參考基因組或轉(zhuǎn)錄組上，目的是進行拼接，或者直接計算轉(zhuǎn)錄本的一些參數(shù)，例如表達量；如果沒有參考基因組，則進行de novo拼接，之后再進行計算相關(guān)參數(shù)，而要對轉(zhuǎn)錄組進行更深入的研究，則需要借助其他技術(shù)，例如數(shù)字基因表達譜技術(shù)[21]，其流程可參考圖1。

圖1 RNA測序及分析的典型流程[29]

RNA-Seq是二代測序技術(shù)的一個重要應(yīng)用，近來發(fā)展較為迅速，已成為對生物體進行轉(zhuǎn)錄組分析和基因表達定量分析的重要途徑[30]。利用RNA-Seq對生物體進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，可以補充擴展該物種的基因數(shù)據(jù)庫，獲得大量的相關(guān)ESTs信息，發(fā)掘一些新的功能基因，有利于后續(xù)的基因克隆和相 關(guān)分子標記的開發(fā)，還可以研究特定組織或細胞基因的時空表達和探索一些未知的小RNA等，為后 續(xù)的研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)[31]。

2 轉(zhuǎn)錄組測序的應(yīng)用

2.1 基因表達水平分析和差異表達分析

生物體細胞中基因的表達特性可以通過mRNA水平(濃度)的測量來表示，在任何組織中以不同水平進行表達均可檢測。由于存在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控(干擾RNA)，相關(guān)的mRNA和相關(guān)的蛋白之間的聯(lián)系并不一定強烈，但是測量mRNA的濃度依然是檢測細胞相關(guān)表達水平和健康與否的一個重要指標[32]。唯一能夠準確判斷個體基因發(fā)生突變的方法是與種系的轉(zhuǎn)錄組序列進行比較。而表達譜芯片技術(shù)可用于研究個體、時間、基因?qū)Ρ磉_的影響，即相同個體在同一時間不同基因的表達差異，相同個體在不同時間里相同基因的表達差異；不同個體的在相同時間相同基因的表達差異等，主要體現(xiàn)表達量的不同[33]。

RNA差異表達分析主要是細胞在不同情況下的表達差異。RNA測序能夠檢測整個轉(zhuǎn)錄組的能力，使得它成為檢測生物體基因表達的重要工具。生物信息學家發(fā)明專用自動化系統(tǒng)來管理數(shù)據(jù)數(shù)量龐大的序列，創(chuàng)造新的算法和軟件進行測序結(jié)果的比較。RNA-Seq 數(shù)據(jù)庫已經(jīng)被用來尋找在特殊途徑中的基因[34]。RNA-Seq數(shù)據(jù)的在微列陣平臺分析的主要優(yōu)點是可以覆蓋整個轉(zhuǎn)錄組，從而有可能解開基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也可以用于檢測和預(yù)測與它們的生物學功能相同的基因的剪接。

2.2 新基因的挖掘

轉(zhuǎn)錄組測序一般是對生物體可表達的全部基因的測序，將得到的序列與公共數(shù)據(jù)庫中已知的序列進行比對，則可以尋找出新的基因并大致預(yù)測其功能[35]，甚至不同物種間的比對也能夠挖掘出目標物種的一些基因。在高等植物基因組測序之后能夠?qū)υ撐锓N的基因組進行組裝和拼接，并且對基因進行QTL定位和功能預(yù)注釋分析，但是目前的研究水平對很多基因研究不深入，位置把握不準，這時候就需要通過轉(zhuǎn)錄組測序，并與物種的性狀進行關(guān)聯(lián)分析，從而對目標基因的分析進行優(yōu)化。

2.3 單核苷酸多態(tài)性分析

轉(zhuǎn)錄組測序之后通過比對到參考基因組能夠發(fā)現(xiàn)大量的SNP (single nucleotide polymorphism)，對SNP的深入分析對生物學的研究具有重要意義。早期轉(zhuǎn)錄組單核苷酸發(fā)掘能夠在Roche 454 sequencing平臺進行分析，而在進行sanger sequencing 驗證中，研究人員能夠在 2 400多個玉米基因獲得差不多5 000個保守的單核苷酸多態(tài)性[36]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，能夠發(fā)現(xiàn)的SNP數(shù)量越來越多，轉(zhuǎn)錄組測序已成為研究生物環(huán)境的影響、發(fā)育調(diào)控、細胞類型等較復(fù)雜分子機制的重要手段，同時也是應(yīng)用于SSR和SNP等分子標記多態(tài)性鑒定的重要前提[37]。RAJEEV等[38]對292個木豆屬()種質(zhì)進行測序，共取得了1 510萬個SNP，其中在基因區(qū)域的SNP達到302萬，對SNP的分析并與性狀進行關(guān)聯(lián)，得到了木豆種質(zhì)的差異和木豆相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)基因區(qū)域。

2.4 基因功能注釋

對轉(zhuǎn)錄組進行測序之后能較直接地進行基因功能注釋?；蚬δ茏⑨屝枰蒙镄畔W方法，將測序得到的未知基因序列在公共數(shù)據(jù)庫進行比對，通過分析與公共數(shù)據(jù)庫中已知基因的聚類或同源性，來預(yù)測目標未知基因的功能。目前使用的基因功能預(yù)測分類系統(tǒng)主要是Gene Ontology(GO)分類和KEGG功能分類[39]。GO采用的思想是聚類分析，聚類是將同一組中的對象與相似的其他組(簇)相比較，從而推測出目標基因的功能。聚類分析包括層次聚類、K-均值聚類、K-中心點聚類和基于網(wǎng)絡(luò)或模型等的一些聚類技術(shù)[40]。KEGG是基于分子水平信息，特別是大型分子數(shù)據(jù)集合而生成的基因組測序數(shù)據(jù)庫和其他高通量實驗得出的數(shù)據(jù)庫資源，是一個有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫，在給出一套完整基因的情況下，它可以對蛋白質(zhì)在各種細胞活動中的作用作出預(yù)估[41]。

3 展望

由于轉(zhuǎn)錄組是參與表達的基因組合，對生物體各性狀的表現(xiàn)具有非常重要的作用，也是基因功能關(guān)系最密切的組學，所以目前轉(zhuǎn)錄組測序是分子生物學發(fā)展最迅速，應(yīng)用相對最廣的一種測序形式，幾乎所有常見并在研的生物體都有進行轉(zhuǎn)錄組方面的研究。轉(zhuǎn)錄組學的研究方向不斷拓展，在自然群體和遺傳群體的材料中有基因定位、基因功能注釋、遺傳進化分析和比較轉(zhuǎn)錄組學等方面的分析，在個體材料中主要有發(fā)育調(diào)控、環(huán)境適應(yīng)，、表觀調(diào)控等方面的分析。在大量生物體進行轉(zhuǎn)錄組研究的背景下，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)，功能被注釋，對生物體的研究將愈發(fā)深入，而基因功能有一定的共通性，這也使得相近物種的研究更加容易。

測序技術(shù)日新月異，隨著三代測序技術(shù)的不斷完善，其實際應(yīng)用也更加臨近，從而使轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果更加準確完整，未來轉(zhuǎn)錄組測序在生物學研究中將扮演更加重要的角色，轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用將更廣，成本更低，使用也更加便捷高效。

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Development and Application of Transcriptome Sequencing

WANG Chubiao1,2, LU Wanhong1, LIN Yan1, LUO Jianzhong1

(1.,,,; 2.)

Transcriptomics has become a hot topic in molecular biology research in recent years. Transcriptome sequencing, which has emerged as a core technology for molecular genetics research, has progressed rapidly from its first to third generation methodologies with great improvement in throughput and accuracy. Currently, the most widely used is second generation sequencing methodology employing one of three sequencing platforms: Roche/454, ABI/Solid, and Illumina/Solexa, each of which has advantages and disadvantages. All of these methodologies rely on transcriptome sequencing using gene chips and examination of gene expression using SAGE, MPSS or RNA-Seq methods, with the latter being that most commonly used. Applications of transcriptome sequencing include analyses of gene expression levels and differential gene expression, mining for new genes, SNP discovery and annotation of gene functions. Transcriptome sequencing is forecast to continue to be an active research area that will continue to develop rapidly and play an increasingly important role in biological research.

Transcriptome; sequencing technology; high throughput; RNA-Seq

Q752

A

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目(2017KJCX031, 2018KJCX027)。

王楚彪(1982— )，男，在讀博士，助理研究員，主要從事林木遺傳育種研究，E-mail:scauwcb@163.com.

羅建中(1969— )，男，博士，研究員，碩導(dǎo)，主要從事林木遺傳育種研究，E-mail:luojz69@hotmail.com.