民族藥材大菟絲子中綠原酸含量的測(cè)定

趙光遠(yuǎn) 李強(qiáng) 靖彩霞 魏穎軒 張鴻沛

【摘?要】?目的：采用高效液相色譜法對(duì)民族藥材大菟絲子中綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定并開(kāi)展方法學(xué)研究;方法：以乙腈-0.05%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相，等度洗脫，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)327nm，采用C18色譜柱，柱溫30℃，外標(biāo)法定量。結(jié)果：綠原酸在0.5275～105.5μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9994），平均回收率為99.2%（RSD=0.5%）。結(jié)論：測(cè)定方法快速、簡(jiǎn)便，符合方法驗(yàn)證要求，可用于大菟絲子中綠原酸含量的測(cè)定和質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】?大菟絲子;高效液相色譜法（HPLC）;綠原酸;含量

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）22-0043-03

Determination?of?Chlorogenic?Acid?in?Ethnic?Medicines?Cuscuta?Japonica?Choisy

ZHAO?Guangyuan?LI?Qiang?JING?Caixia?WEI?Yingxuan?ZHANG?Hongpei

BaoTou?Food?and?Drug?Inspection?&?Testing?Center，?Baotou?014060，?China

Abstract：Objective?Establish?a?method?for?determination?of?chlorogenic?acid?in?Cuscuta?Japonica?Choisy?with?HPLC.?Methods?The?mobile?phase?was?consisted?of?acetonitrile-0.05%?phosphoric?acid?aqueous?solution?（10∶90），?The?flow?rate?was?1.0?mL/?min，?the?detective?wavelength?was?327?nm?and?the?C18?column?temperature?was?30℃.With?external?standard?method?to?make?quantitative?analysis.Results?The?linear?range?of?the?method?was?0.5275?～105.5μg/mL，?the?average?recovery?was?99.2%，RSD?was?0.5%.?Conclusion?This?method?is?simple，?fast?and?efficient，?which?will?be?used?to?provide?accurate，?scientific?quality?control?for?determination?of?chlorogenic?acid?in?Cuscuta?Japonica?Choisy.

Keywords：Cuscuta?Japonica?Choisy;?HPLC;?Chlorogenic?acid;?Content?Determination

大菟絲子Cuscuta?japonica?Choisy.又名日本菟絲子，為旋花科菟絲子屬植物金燈藤的干燥成熟種子。秋季果實(shí)成熟時(shí)采收植株，曬干，打下種子，除去雜質(zhì)，即可，為少數(shù)民族藥材，不得代替菟絲子，藥用時(shí)應(yīng)分別入藥[1]?！秲?nèi)蒙古中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1988年版）和《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）均收載該品種，大菟絲子性辛、甘、平，具有補(bǔ)肝腎、益精髓、明目的作用，可用于腰膝酸痛、遺精、消渴、目暗、尿頻、淋瀝?！秲?nèi)蒙古中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中收錄大菟絲子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅制定了[性狀]和[檢查]項(xiàng)[1]，《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收錄的大菟絲子也缺少指標(biāo)成分作為含量控制項(xiàng)目[2]，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]，大菟絲子含黃酮類(lèi)化合物、甾類(lèi)化合物和有機(jī)酸等，有機(jī)酸主要含有咖啡酸和綠原酸，其中綠原酸具有抗病毒、保肝利膽作用。瞿燕等[4]利用HPLC?法建立了大菟絲子生品和炮制品的特征圖譜，探討大菟絲子炮制前后化學(xué)成分的變化規(guī)律，并未對(duì)大菟絲子中綠原酸含量測(cè)定方法做系統(tǒng)性研究。馮華等[5]對(duì)黔產(chǎn)大菟絲子中綠原酸含量進(jìn)行了測(cè)定，樣本收集僅限于貴州地區(qū)，而大菟絲子分布于我國(guó)南北各省，越南、朝鮮、日本也有[6]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)地及韓國(guó)、朝鮮的9批次大菟絲子中的綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定，考察不同產(chǎn)地大菟絲子中綠原酸的含量差異，為提高和完善大菟絲子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1?儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，PDA檢測(cè)器;島津UV-2450紫外分光光度計(jì);KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器。

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201716;中國(guó)食品藥品檢定研究院）;大菟絲子為包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心收集制備并確定基源。乙腈為色譜純;水為高純水;其他試劑均為分析純。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件與系統(tǒng)適用性?采用SHIMADZU??VP-ODS色譜柱（150mm×4.6mm，5μm），以乙腈-0.05%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相進(jìn)行流動(dòng)相條件摸索，流速1.0mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。綠原酸峰的理論塔板數(shù)均大于7000，與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5。

2.2?溶液配制

2.2.1?對(duì)照品溶液的配制?精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品10.55mg，置50mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液10mL置100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為21.10μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2?供試品溶液的制備?取大菟絲子粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率200W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇水混合溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3?采集波長(zhǎng)的確定?取對(duì)照品溶液置于紫外分光光度計(jì)上，在210～350?nm波長(zhǎng)范圍掃描。結(jié)果表明綠原酸在327?nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇327?nm作為其含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)，后續(xù)方法學(xué)考察結(jié)果也表明在該波長(zhǎng)下測(cè)定數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠。典型色譜圖如圖1和圖?2所示。

2.4?線性關(guān)系考察?準(zhǔn)確稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品10.55mg，置50mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液（211.0μg/mL），分別精密量取儲(chǔ)備液0.5mL、1mL、2mL、2.5mL、1mL、1mL、2mL、2.5mL置200mL、100mL、100mL、50mL、10mL、5mL、5mL、5mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，得到系列濃度見(jiàn)表2，分別測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，回歸方程為：y?=34310x-38873?（x為濃度，y為峰面積）?r=0.9994。綠原酸在0.5～105μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5?精密度試驗(yàn)?精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液（濃度為21.10μg/mL）10μL，注入高效液相色譜儀，?按“2.1”?項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，?記錄綠原酸圖譜，?綠原酸平均峰面積值為655031，RSD為0.3%。表明方法的精密度良好。

2.6?穩(wěn)定性考察?取同一份供試品溶液，過(guò)濾后室溫放置，分別在0?h、2?h、4?h、8?h、12?h、24?h后按2.1中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，放置不同時(shí)間的峰面積RSD為0.2%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7?重復(fù)性試驗(yàn)?稱(chēng)取同一供試品6份，分別照2.2.2處理并測(cè)定綠原酸含量，6份供試品綠原酸平均含量為0.1772%，RSD為0.6%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8?加樣回收率試驗(yàn)?取已測(cè)定含量（含量0.1772%）?的同一供試品6份，每份約0.25?g，精密稱(chēng)定，分別置6個(gè)具塞錐形瓶中，各精密加入濃度為180.0μg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液各2.50mL及50%甲醇溶液47.5mL，按2.2.2中供試品處理方法進(jìn)行處理并測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表4，綠原酸的平均回收率（n=6）為99.2%，RSD=0.5%，表明該方法回收率良好。

3?樣品含量測(cè)定

取9批材大菟絲子，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1方法測(cè)定綠原酸含量（以干基計(jì)）。結(jié)果見(jiàn)表5。

4?討論

選用甲醇和水溶混合溶劑劑提取，分別考察15?min、30?min、45?min不同超聲提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取30min，綠原酸已經(jīng)基本提取完全;在提取過(guò)程中，改變甲醇-水比例（25%、50%、75%）進(jìn)行提取溶劑比例的考察，發(fā)現(xiàn)以50%甲醇的提取效果較為理想。

通過(guò)對(duì)9個(gè)不同產(chǎn)地大菟絲子中綠原酸含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)：綠原酸含量最高的為0.7789%（7號(hào)樣，河南），含量最低的為0.1786%（4號(hào)樣，云南），不同產(chǎn)地的大菟絲子中綠原酸的含量差異明顯，相差4倍多，制定相應(yīng)質(zhì)量指標(biāo)限度時(shí)需要進(jìn)一步考察多產(chǎn)地藥材數(shù)據(jù)結(jié)果。中藥材中綠原酸含量測(cè)定方法中多以磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相酸度[7]，在方法制定及9批大菟絲子中綠原酸含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，使用磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相酸度時(shí)，濃度不宜過(guò)高，流動(dòng)相pH值過(guò)低容易造成色譜柱固定相的水解流失，引起柱效下降甚至損壞[8]，在滿(mǎn)足要求的前提下盡量降低使用濃度，因此，本方法流動(dòng)相采用的磷酸溶液濃度為0.05%，其pH值為2.2，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求的同時(shí)也不會(huì)對(duì)色譜柱造成損壞。

綜上結(jié)果表明本法可靠，準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，對(duì)色譜柱破壞小，可作為大菟絲子中綠原酸含量的分析方法，同時(shí)9批大兔絲子中綠原酸含量的測(cè)定結(jié)果也為相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)中指標(biāo)成分的限度制定提供參考數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳編.內(nèi)蒙古中藥材標(biāo)準(zhǔn)（第二冊(cè)）[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳，1988：47.

[2]貴州省食品藥品監(jiān)督管理局編.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003：39.

[3]郭澄，王雅君，張劍萍.菟絲子的化學(xué)成分和藥理活性研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（10）：1035-1036.

[4]瞿燕，李瓊，魏文龍，等.大菟絲子生品和鹽炙品HPLC-UV特征圖譜及7個(gè)有機(jī)酸含量變化研究[J].藥物分析雜志，2014，34（5）：824-829.

[5]馮華，石尚友，羅秀瓊，等黔產(chǎn)大菟絲子中綠原酸的定性與定量分析，中國(guó)民族民間醫(yī)藥2017，26（5）：14-16.

[6]歐恒熙.大菟絲子炮制工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].貴陽(yáng)：貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，2013.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：30，54.

[8]中國(guó)藥品生物制品鑒定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（2010年版）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：90.

（收稿日期：2019-09-10?編輯：劉?斌）