分子印跡固相萃取-高效液相色譜法測定植物油中11種多環(huán)芳烴

張 冰 張 蕊葉 金吳 宇軒志宏 謝 剛王松雪馬海華

(國家糧食局科學(xué)研究院1，北京 100037)(河南工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院2，鄭州 450000)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是指含有兩個或兩個以上稠合苯環(huán)的化合物，是一類化學(xué)致癌物和環(huán)境污染物，因此國內(nèi)外植物油相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中均對PAHs做出嚴(yán)格的限量規(guī)定。歐盟關(guān)于食品中多環(huán)芳烴的條例(EU) NO 835/2011[1]中規(guī)定了可直接消費或作為食品成分的油脂中苯并(a)芘的最高殘留限量為2 μg/kg，同時要求苯并(a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)熒蒽、四種(PAH4)總量不超過10 μg/kg。GB 2716—2005 《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[2]也明確規(guī)定了植物油中苯并(a)芘含量應(yīng)小于等于10.0 μg/kg。同時，GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》[3]對油脂及其制品中苯并(a)芘做出相同的限量規(guī)定。

植物油中主要成分甘油三酯及其脂肪伴隨物嚴(yán)重影響著多環(huán)芳烴的分析檢測，因此植物油中多環(huán)芳烴的提取凈化是檢測植物油中多環(huán)芳烴的關(guān)鍵。目前主要的提取凈化方法有液液萃取法[4]、固相萃取法[5](SPE)、固相微萃取法[6](SPME)、凝膠滲透色譜法[7](GPC)等。近幾年來，分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers, MIPs)受到越來越多的關(guān)注。MIPs是以目標(biāo)分子為模版，將具有結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的功能單體通過共價鍵或非共價方式和模版分子結(jié)合，進(jìn)行聚合反應(yīng)，再洗脫模版分子得到。MIPs作為固體吸附劑在固相萃取、基質(zhì)固相分散萃取、固相萃取、攪拌棒吸附萃取和磁萃取等前處理中有著廣泛的應(yīng)用[8]。分子印跡固相萃取(molecularly imprinted polymer solid-phase extraction, MIP-SPE)通過將分子印跡技術(shù)和固相萃取技術(shù)相結(jié)合，以分子印跡聚合物為固相萃取的吸附劑，克服了傳統(tǒng)固相萃取選擇性差的缺點，對目標(biāo)組分特異性的吸附結(jié)合，在生物、食品、環(huán)境等復(fù)雜樣品中有很好的應(yīng)用[9]。胡園等建立分子印跡固相萃取結(jié)合超高校液相熒光法測定螺中15種多環(huán)芳烴的方法，在5、10、20 μg/kg加標(biāo)水平下，15種PAHs回收率73.07%～108.06%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.6%～9.2%[10]。朱琳等[11]通過高分子印跡固相萃取-氣相串聯(lián)質(zhì)譜法測定動植物油脂中15+1種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴，16種PAHs回收率37.90%～105.24%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。

常用的PAHs檢測方法有氣相串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、液相串聯(lián)質(zhì)譜法[12]、高效液相色譜法[7]、熒光光譜法[13]等方法，其中氣相串聯(lián)質(zhì)譜法難以應(yīng)對高沸點PAHs檢測，對熱穩(wěn)定性較差的多環(huán)芳烴檢測較差。液相質(zhì)譜聯(lián)用儀器昂貴，對人員要求較高。熒光光譜法不適用于多組分PAHs的同時檢測。而高效液相色譜-熒光檢測器法，儀器較為普及，相對其他測定方法有靈敏度高，檢出限低，檢測種類多，分析時間短等優(yōu)勢，可用于包括高沸點PAHs在內(nèi)的多種PAHs的同時定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

12種食用植物油樣品，葵花籽油、菜籽油、芝麻油、大豆油、玉米油、花生油和橄欖油等，購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

二氯甲烷、正己烷、環(huán)己烷、乙腈，色譜純； EPA16多環(huán)芳烴混標(biāo),溶解于乙腈溶劑；SPE固相萃取柱Cleanert PAH MIP；液相色譜柱Athena PAHs HPLC Column, 4.6 × 250 mm, 5 μm。

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，配備熒光檢測器；12位固相萃取裝置。

1.3 樣品處理

稱取0.5 g植物油樣品至15 mL離心管中，3 mL環(huán)己烷溶解，所使用容器事先均經(jīng)過正己烷清洗排除本底值干擾。分子印跡柱經(jīng)過10 mL二氯甲烷和5 mL環(huán)己烷活化平衡，將3 mL溶解樣品的環(huán)己烷加入到固相萃取柱中，用4 mL環(huán)己烷淋洗抽干小柱，再用10 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫后的樣品溶液氮吹至近干，1 mL乙腈定容，上機(jī)測定。

1.4 儀器條件

梯度洗脫：流動相A：乙腈，流動相B：超純水；流速：1.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。流動相梯度條件見表1，熒光檢測器熒光條件設(shè)置波長見表2。

表1 多環(huán)芳烴梯度洗脫條件

表2 多環(huán)芳烴熒光條件參數(shù)設(shè)置

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取前處理條件優(yōu)化

2.1.1 淋洗體積用量的優(yōu)化

本實驗選用環(huán)己烷[14]作為淋洗溶劑，淋洗的主要目的在于去除甘油三酯及其他油脂伴隨物，避免這些物質(zhì)影響多環(huán)芳烴的分離和檢測?？疾炝?、4、5、6、8 mL淋洗體積環(huán)己烷的淋洗效果。圖1為五種不同體積的環(huán)己烷淋洗后洗脫液中干物質(zhì)質(zhì)量關(guān)系圖。結(jié)果顯示，經(jīng)過不同體積環(huán)己烷淋洗后洗脫液干物質(zhì)的質(zhì)量分別為0.038、0.021、0.015、0.012、0.010 g，說明樣品中甘油三酯及其他油脂伴隨物隨著淋洗體積的增大而逐漸被洗出。圖2為11種多環(huán)芳烴不同淋洗體積下的回收率，2 mL淋洗多環(huán)芳烴回收率為91.89%～108.95%，重質(zhì)的多環(huán)芳烴回收率低于其他淋洗體積，原因可能是重質(zhì)多環(huán)芳烴與分子印跡聚合物結(jié)合力相對弱，淋洗時少量重質(zhì)多環(huán)芳烴與甘油三酯一同被洗出。通過優(yōu)化選擇4 mL作為最優(yōu)的淋洗體積用量，在保證回收率的前提下，可淋洗出大部分甘油三酯，減少對后續(xù)分離檢測的干擾。

圖1 不同淋洗體積條件的優(yōu)化

圖2 不同淋洗體積時11種多環(huán)芳烴回收率

2.1.2 洗脫劑用量的優(yōu)化

實驗中采用中等極性的二氯甲烷作為洗脫溶劑，對洗脫劑用量進(jìn)行了優(yōu)化。本實驗共使用15 mL二氯甲烷洗脫樣品，分三段收集，第一段：0～7 mL；第二段7～10 mL；第三段10～15 mL，并進(jìn)行液相色譜檢測。結(jié)果顯示，第三段洗脫液中未檢出任何多環(huán)芳烴組分，第二段洗脫液中檢出少量輕質(zhì)的PAHs，其他組分在第一段7 mL內(nèi)被洗脫完全。為保證11種多環(huán)芳烴能完全被洗脫，本實驗選取10 mL做為最佳洗脫體積。

2.1.3 色譜條件的優(yōu)化

實驗中優(yōu)化了流動相梯度，通過在合適時間改變流動相的比例達(dá)到對11種多環(huán)芳烴的良好分離(表1)，優(yōu)化確定了各目標(biāo)物的最佳發(fā)射波長和激發(fā)波長(表2)，11種PAHs的色譜圖見圖3。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 線性范圍、檢出限及定量下限

11種多環(huán)芳烴的線性范圍、檢出限及定量限等見表3，配制11種多環(huán)芳烴系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在各自線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于

注：從左到右順序為：蒽、熒蒽、芘、苯并(a)蒽、、苯并(b)熒蒽、苯并(a)芘、二苯并(a,h)蒽、苯并(k)熒蒽、苯并(g,h, i)苝和茚并(1,2,3-c,d)芘。圖3 11種PAHs的色譜圖

多環(huán)芳烴線性范圍/ng/mL線性關(guān)系相關(guān)系數(shù)/R2檢出限/μg/kg定量限/μg/kg蒽(ANT)0.5～200y= 284 739x+200 8320.999 70.100.33熒蒽(FT)0.5～200y=120 984x+58 9100.999 90.100.33芘(PYR)0.5～200y=253 517x+151 7330.999 70.100.33苯并(a)蒽(BaA)0.5～200y=363 690x+149 3180.999 80.060.20(CHR)0.5～200y=340 938x+171 1160.999 80.050.17苯并(b)熒蒽(BbF)0.5～200y=216 334x+97 0920.999 70.100.33苯并(k)熒蒽(BkF)0.5～200y=1428 669x+487 6410.999 90.030.10苯并(a)芘(BaP)0.5～200y=787 056x-227 8070.999 90.060.20二苯并(a,h)蒽(DahA)1.5～200y= 440 383x+119 5840.999 90.401.30苯并(g,h,i)苝(BghiP)1.0～200y=283 648x+63 6200.999 60.250.83茚并(1,2,3-c,d)芘(IP)5.0～200y=41 398x+13 3920.999 71.505.00

0.999 6，具有非常好的線性關(guān)系。對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級稀釋，以3倍性噪比(S/N)計算檢出限(LOD)，10倍信噪比計算定量下限(LOQ)?？梢钥闯?，苯并芘的LOQ明顯低于我國植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中對苯并芘10 μg/kg的限量要求，同時也低于歐盟2 μg/kg的限量要求，其他未有限量規(guī)定的多環(huán)芳烴的LOQ也均小于5 μg/kg，說明本方法靈敏度高，完全滿足日常檢測的需要。

2.2.2 準(zhǔn)確度與精密度

取橄欖油和大豆油空白植物油樣品，分別添加高、中、低共4個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2樣品處理”方法進(jìn)行處理，每個加標(biāo)水平進(jìn)行3次重復(fù)實驗，添加濃度、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表4和表5。11種多環(huán)芳烴的回收率均在63.5%～118.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～10.2%。從表4和表5還可以看出，不同品種的植物油，部分多環(huán)芳烴的回收率有差距，說明不同品種油脂組分的差別，對淋洗和洗脫效果有影響。以20 μg/kg的大豆油空白加標(biāo)樣品比對本方法和國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.265—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多環(huán)芳烴的測定》[3]。本方法測定11種多環(huán)芳烴含量在15.3～19.8 μg/kg，加標(biāo)回收率為83.6%～100.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～4.9%；而國標(biāo)方法檢測結(jié)果在12.3～18.9 μg/kg，加標(biāo)回收率為61.7%～94.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～15.7%。兩種方法的加標(biāo)回收率、精密度和準(zhǔn)確度上均滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中對檢測方法的技術(shù)要求，但由于本方法前處理步驟更少，方法快速和簡單，因此在方法準(zhǔn)確度和精密度上要優(yōu)于現(xiàn)有國標(biāo)方法。

表4 橄欖油11種多環(huán)芳烴的加標(biāo)回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

表5 大豆油11種多環(huán)芳烴的加標(biāo)回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.3 實際樣品的測定

應(yīng)用本方法對本地超市購買的12個植物油樣品進(jìn)行測定，結(jié)果如表6所示，12個植物油中有5種檢出苯并(a)芘，苯并(a)芘檢出率在42%，所有檢出樣品的苯并(a)芘含量均符合我國限量要求，但按照歐盟對植物油中苯并(a)芘的限量要求，則有兩個樣品的結(jié)果超標(biāo)，超標(biāo)率為16.7%。12個植物油中PAH4均有檢出，且PAH4總量超標(biāo)率高達(dá)75%。從結(jié)果上看，植物油中含致癌物和2B類致癌物的PAH4污染較為嚴(yán)重，普遍存在，急需加強(qiáng)日常監(jiān)測。目前我國只對植物油中苯并(a)芘做出限量要求，應(yīng)加緊制定對植物油中PAH4的限量標(biāo)準(zhǔn)，最大限度保護(hù)人民身體健康。

表6 實際植物油樣品的11種多環(huán)芳烴檢測結(jié)果/μg/kg

注：ND表示未檢出。

3 結(jié)論

本研究基于分子印跡固相萃取技術(shù)建立了植物油中11種多環(huán)芳烴的檢測方法，通過采用分子印跡固相萃取，可有效提高多環(huán)芳烴在植物油中的提取率，和標(biāo)準(zhǔn)方法相比，大大減少前處理時間和溶劑成本，同時避免復(fù)雜前處理過程導(dǎo)致的目標(biāo)物損失。11種多環(huán)芳烴的回收率均在63.5%～118.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～18.2%。本方法的定量下限符合國內(nèi)外對多環(huán)芳烴的限量要求，可滿足大量樣品快速、準(zhǔn)確定量分析的需要，可用于日常植物油質(zhì)量安全的檢測和監(jiān)測工作，進(jìn)一步保證我國植物油質(zhì)量安全。