鈣蛋白酶-2、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達(dá)與瓣膜性房顫發(fā)生的關(guān)系

瓣膜性房顫主要是由于心腔擴(kuò)大、心臟瓣膜狹窄等一系列心臟形態(tài)學(xué)變化及心血管壓力改變引起的心臟瓣膜病，易繼發(fā)性引起瓣膜性房顫，多發(fā)于老年人，其危險程度較高，嚴(yán)重影響人們的生活水平和生命健康問題，隨著我國老齡化進(jìn)程的加快，此類疾病亟須尋求更科學(xué)的治療方案。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴酶廣泛分布于身體各個組織，參與多個信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)人體的各種生物學(xué)反應(yīng)。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CaN-NFAT通路在維持心臟正常形態(tài)尤其是心臟瓣膜與心隔的形成過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。鈣蛋白酶-2參與多種底物的催化過程。鈣蛋白酶-2常見于在心房肌細(xì)胞表達(dá)，心內(nèi)膜和心外膜未見表達(dá)[2-3]。激活鈣蛋白酶-1所需的Ca2+濃度為微摩爾級，而激活鈣蛋白酶-2所需的Ca2+濃度為毫摩爾級[4]。正常生理情況中Ca2+濃度較低僅能激活鈣蛋白酶-1，這意味著在病理情況下才會激活鈣蛋白酶-2，進(jìn)而引起疾病的發(fā)生與發(fā)展[5]。本研究分析心臟瓣膜病病人心肌組織中鈣蛋白酶-2、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達(dá)水平與瓣膜性房顫發(fā)生的關(guān)系，以推測瓣膜性房顫的發(fā)病機(jī)制，并尋求新的治療方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年6月—2016年4月在我院因心臟瓣膜病住院接受瓣膜置換手術(shù)的病人78例，診斷根據(jù)2016年中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)會制定的標(biāo)準(zhǔn)，對病人可能干擾試驗因素進(jìn)行排查，并對內(nèi)部構(gòu)成因素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化比較，篩選出符合條件受試者48例。男26例，女22例；年齡37歲～72歲(56歲±7歲)。根據(jù)心電圖結(jié)果分為竇性心律組(22例)和房顫組(26例)，搜集臨床資料，病人均已知情并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：極速性心房顫動(心率>180次/min)、由神經(jīng)因素引起的非瓣膜性心房纖顫、先天性心臟瓣膜病病人。

1.2 檢測儀器 美國惠普8500型彩色多普勒超聲診斷儀(HP8500)；美國SH38-iS ITAT血氣分析儀；美國Biofuge Stratos離心機(jī)、美國多功能酶標(biāo)儀SPECTRA max M2、轉(zhuǎn)移電泳槽、聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直電泳槽、日本富士化學(xué)發(fā)光成像分析儀LAS-4000、德國KMO2基本型磁力攪拌器、漩渦振蕩器、脫色搖床、冰箱。

1.3 檢測試劑及材料 鼠抗人CaN單克隆抗體、兔抗人鈣蛋白酶-2多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、Western -抗稀釋液、ELC發(fā)光試劑盒、RIPA裂解液、蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、SDS-PAGE上樣緩沖液、預(yù)染蛋白Marker、30%聚丙烯酰胺、三-羥甲基-氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、EP管、移液槍等生化試驗器材。

1.4 檢測方法 兩組均在心臟病瓣膜置換手術(shù)建立體外循環(huán)心臟停跳前，切取右心耳心肌組織并迅速放入液氮中，轉(zhuǎn)移至冰箱中以-80 ℃進(jìn)行保存，獲取標(biāo)本。

一般資料：性別、年齡、身高、體重、視診有無二尖瓣面容、吸煙史、飲酒史、血壓、心率、血紅蛋白含量及內(nèi)科用藥情況(地高辛、利尿藥、β受體阻斷藥及其他內(nèi)科用藥)。心臟形態(tài)學(xué)指標(biāo)：左房內(nèi)徑、左室內(nèi)徑、右室內(nèi)徑、室間隔厚度、左室后壁厚度、心胸比例、二尖瓣瓣口面積。 血氣指標(biāo)：左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。蛋白質(zhì)表達(dá)情況：采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測鈣蛋白酶-2和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達(dá)水平。 蛋白酶-2、CaN蛋白表達(dá)水平：采用Western Blot法檢測，步驟依次為：總蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE凝膠的配置、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗結(jié)合、洗膜、二抗結(jié)合、化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)情況。最終得到Western Blot蛋白顯影圖像。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料及用藥情況比較 兩組年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、吸煙、飲酒、血壓及血紅蛋白含量指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但房顫組心率較竇性心律組明顯偏高，查病人是否存在二尖瓣面容，房顫組數(shù)據(jù)明顯高于竇性心律組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；比較兩組用藥情況，房顫組服用地高辛的比例明顯高于竇性心律組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，比較兩組服用利尿劑、β受體阻斷藥及其他藥物的使用情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 竇性心律組和房顫組臨床資料比較

2.2 兩組心胸比例、二尖瓣瓣口面積比較 房顫組心胸比例高于竇性心律組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；房顫組二尖瓣瓣口面積較竇性心律組明顯縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

2.3 兩組超聲心動圖檢查結(jié)果 竇性心律組左室射血分?jǐn)?shù)值明顯高于房顫組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；超聲檢查房顫組左房內(nèi)徑較竇性心律組明顯增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但檢查兩組左室內(nèi)徑、右室內(nèi)徑、室間隔厚度及左室后壁厚度時兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表2 竇性心律組與房顫組心胸比例、二尖瓣瓣口面積比較(±s)

表3 竇性心律組與房顫組病人超聲心動圖指標(biāo)的比較(±s)

2.4 兩組心肌組織鈣蛋白酶-2、CaN表達(dá)情況 房顫組心肌組織中鈣蛋白酶-2表達(dá)水平為(0.85±0.38)，高于竇性心律組的(0.48±0.21)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；比較兩組鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達(dá)水平，房顫組為(1.25±0.47)，明顯高于竇性心律組的(0.81±0.32)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

瓣膜性心臟病是一種常見于老年人的疾病，由于心臟瓣膜關(guān)閉不全常繼發(fā)性引起心房纖顫，隨著社會環(huán)境的改變，瓣膜性心臟病的發(fā)病年齡趨于年輕化，發(fā)病率增高，心血管壓力的升高、蛋白因子表達(dá)的變化引起的心腔室擴(kuò)大、形態(tài)改變以及心臟瓣膜面積的改變是此病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種依賴Ca2+激活的信號酶，其在身體各個組織中均有表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的信號交流、功能作用。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化T細(xì)胞核因子信號通路具有維持心血管系統(tǒng)正常的生理、形態(tài)功能的作用，并且對心血管病理生理過程具有一定的調(diào)節(jié)作用。在心血管形態(tài)發(fā)生、心臟瓣膜形成、血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育、冠狀血管以及成熟心臟纖維基質(zhì)的形成等心血管發(fā)育過程中均存在此信號的調(diào)節(jié)[5-8]。在心臟胚胎發(fā)育時期CaN-NFAT通路在最終發(fā)育為心臟瓣膜的心肌組織中呈高水平表達(dá)，表明其在心臟的組織胚胎學(xué)發(fā)育中的心臟瓣膜與心隔的形成中具有重要作用。當(dāng)心內(nèi)膜墊內(nèi)膜細(xì)胞即將從心內(nèi)膜層分離并轉(zhuǎn)分化為間葉樣細(xì)胞時，心臟瓣膜開始形成[9]。NFAT蛋白通常與多嘌呤核苷酸序列相(A/T)GGAAAA結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄子和增強(qiáng)子的活性以促進(jìn)心內(nèi)膜細(xì)胞的增生[10]。NFAT還參與介導(dǎo)心臟心內(nèi)膜VEGF信號傳導(dǎo)通路，參與心內(nèi)膜墊的形成。在胚胎初期，NFAT具有調(diào)節(jié)血管平滑肌與血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的作用，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，NFATcl進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與環(huán)氧化酶-2(COX-2)啟動子上的特定位點相結(jié)合，從而激活COX-2的轉(zhuǎn)錄，而COX-2是前列腺素合成的關(guān)鍵酶，其在血管內(nèi)皮的遷移和血管形成過程中是一種必不可少的物質(zhì)[11]。 鈣蛋白酶-2在心房纖顫病人的心肌組織中呈高水平表達(dá)，又由于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是其催化底物，由此推斷鈣蛋白酶-2可通過調(diào)節(jié)CaN活性以調(diào)控參與CaN-NFAT通路，繼而導(dǎo)致瓣膜性房顫的發(fā)生。

本研究中，房顫組病人心肌組織的鈣蛋白酶-2、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶水平均明顯高于竇性心律組，房顫組的心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)以及心臟瓣膜面積均發(fā)生病理性的改變，這個結(jié)果也印證了鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶參與的CaN-NFAT通路通過影響心臟心肌組織及心臟瓣膜的正常形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引發(fā)瓣膜關(guān)閉不全引起心房纖顫。

心肌組織中鈣蛋白酶-2、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白的表達(dá)影響了心肌組織正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，改變了心臟瓣膜的面積，引發(fā)了瓣膜性心房纖顫。