高純度神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離與鑒定

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神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腦部惡性腫瘤，是最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，盡管目前在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷、外科手術(shù)以及放化療上取得了很大的進(jìn)步，但是目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤在治療上仍面臨著很大的困難，預(yù)后較差。就目前而言，神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人接受廣泛外科手術(shù)切除和術(shù)后輔助放化療后平均生存期時(shí)間在14.6個(gè)月左右[1]。然而，最近10年在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)的研究上大大提高了對(duì)惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)，特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，它是一個(gè)罕見(jiàn)的具有腫瘤干細(xì)胞特點(diǎn)的族群，這可能對(duì)研究惡性膠質(zhì)瘤治療后復(fù)發(fā)有幫助，和干細(xì)胞相似，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有自我更新復(fù)制能力，耐放療及耐化療，而且在大腦里面有侵襲轉(zhuǎn)移能力以及很高的增殖潛能。少量神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞經(jīng)過(guò)治療后幸存下來(lái)并快速增殖，重新形成膠質(zhì)瘤[2]。因此，最新的抗膠質(zhì)瘤治療研究進(jìn)展中旨在消除膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，防止惡性膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可能在腫瘤發(fā)生和腫瘤的復(fù)發(fā)中發(fā)揮著重要作用，找到能徹底殺滅神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的方法，消除這種神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞種群，可能給臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤帶來(lái)新的希望。因此，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的功能分析和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)的了解至關(guān)重要。這些發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性和對(duì)腦部腫瘤靶向治療提供了一個(gè)開(kāi)放的新視角。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)分離提取并鑒定神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，對(duì)后期神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制、治療及取得良好的治療效果進(jìn)行前期研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 十堰市太和醫(yī)院神經(jīng)外科術(shù)中的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，術(shù)后病理診斷為間變型星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，WHOⅢ級(jí)，IHC：GFAP(+)，S-100(+)，NeuN(-)，Ki-67(20%)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 病人術(shù)前未行放化療和手術(shù)。取5個(gè)位點(diǎn)的腦腫瘤組織各1塊，直徑(5～10) mm，浸入無(wú)菌2 mL 無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液瓶中保鮮，外加無(wú)菌敷料嚴(yán)密包被，立即于30 min內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。吸出標(biāo)本瓶中上層液體，加入0.05%的胰蛋白酶2 mL于標(biāo)本瓶中，吸引管反復(fù)吹打混勻消化后，移入培養(yǎng)皿中，剪刀反復(fù)剪碎，剪成更小組織碎片，玻片反復(fù)研磨，10%FBS終止消化；吸引管反復(fù)吹打，重懸，混勻后200篩網(wǎng)過(guò)濾，然后將過(guò)濾后的液體于離心機(jī)上以1 000 r/min離心5 min，去上清。再用PBS液反復(fù)洗滌3次，離心后去上清。制成單細(xì)胞懸液，最后將細(xì)胞濃度調(diào)整為(0.5～1.0)×108個(gè)/mL，于多聚賴氨酸預(yù)處理過(guò)的六孔板上分別種植單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞種植在每一孔中，加入含有神經(jīng)生長(zhǎng)因子(20 ng/mL，bFGF、20 ng/m，EGF；2%B27)和雙抗無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液18 mL，放入含有5%的二氧化碳(CO2)、37 ℃常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)和速度以及培養(yǎng)基pH的高低來(lái)觀察，進(jìn)行換液(3 d～4 d 1次)。然后進(jìn)行定期傳代培養(yǎng)。取傳代培養(yǎng)第3代生長(zhǎng)良好的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行Nestin、CD133的免疫熒光化學(xué)檢測(cè)，然后利用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，制成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液種植在預(yù)冷的無(wú)菌玻片上，依此制作6張玻片，室溫下靜置晾干。于75 ℃環(huán)境下烘烤玻片1 h，然后進(jìn)行G帶染色。顯微拍照攝影，于放大后進(jìn)行膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的染色體核型分析。利用CD133細(xì)胞磁珠分離技術(shù)使CD133正負(fù)細(xì)胞被洗滌分離。 取免疫磁珠分選系統(tǒng)分離的CD133+細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×106個(gè)，加入40 μL 0.01 mol/L的PBS液和CD133抗體，混合均勻后放入4 ℃環(huán)境中靜置10 min，加入300 μL 0.01 mol/L的PBS液，分9次送流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133+細(xì)胞的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)出神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)第3天開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞球(見(jiàn)圖1)，5 d～7 d之后逐漸形成大量細(xì)胞球，每個(gè)球包含(4～8)個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞球呈現(xiàn)球形或橢圓形的外表，內(nèi)部細(xì)胞排列整齊嚴(yán)密，并且折光性好。2周內(nèi)，大多數(shù)區(qū)域的細(xì)胞球增加到它們直徑的(5～10)倍。部分細(xì)胞球出現(xiàn)突起，呈放射狀生長(zhǎng)，形態(tài)多不規(guī)則，可見(jiàn)有星形、多角形、樹(shù)枝狀。3 d換液1次，然后視細(xì)胞球生長(zhǎng)情況進(jìn)行傳代，(7～9)天/次(見(jiàn)圖2)。每次傳代前，于顯微鏡下培養(yǎng)皿中可見(jiàn)懸浮的結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)液中搖擺，此即神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，一般于每次傳代后(1～2)d就可看到神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的形成，隨著培養(yǎng)時(shí)間慢慢地延長(zhǎng)，形態(tài)與原代大致相同。

圖1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)第3天

圖2 顯微照相傳代后形成的神經(jīng)球(100×)

2.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞團(tuán)的免疫熒光染色 懸浮的細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示Nestin、CD133染色陽(yáng)性(見(jiàn)圖3和圖4)，而培養(yǎng)皿底部貼壁的細(xì)胞Nestin、CD133染色均呈現(xiàn)陰性。

CD133染色為陽(yáng)性，呈紅色，用DAPI紫色復(fù)染

圖3神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞團(tuán)的免疫熒光染色顯示(100×)

Nestin染色為陽(yáng)性圖4 神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞團(tuán)的免疫熒光染色(200×)

2.3 神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的染色體核型分析 神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和正常的神經(jīng)干細(xì)胞在干細(xì)胞功能和生物學(xué)特征上有許多相似之處，為了對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞球進(jìn)行區(qū)分，對(duì)所培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球進(jìn)行了染色體核型分析檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)該細(xì)胞球的性質(zhì)，結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球的細(xì)胞核染色體均為非整倍體，即異倍體，且其中有部分染色體呈現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，染色體上存在部分基因片段的缺失(見(jiàn)圖5)。染色體核型分析結(jié)果為：45XY，-10，del(5)(p15)，del(16)(p；q)。

圖5 神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球的染色體核型檢查G顯帶

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(見(jiàn)表1) 經(jīng)免疫磁珠分選系統(tǒng)分離后，通過(guò)流式細(xì)胞儀得到CD133+細(xì)胞在總分離后細(xì)胞數(shù)的比例為(86.83±5.12)%，獲得了高純度的CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(見(jiàn)圖6)。

3 討 論

在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中，新的治療方法顯得非常重要，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是目前研究的熱點(diǎn)，可能為治療膠質(zhì)瘤提供新的途徑[3]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是一種在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中罕見(jiàn)的具有腫瘤干細(xì)胞特點(diǎn)的族群，和干細(xì)胞很相似，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有自我更新復(fù)制、耐放療及耐化療能力，在大腦內(nèi)有生長(zhǎng)迅速、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)等特點(diǎn)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是Ignatova等在使用一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞球進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)第一個(gè)分離出來(lái)的[4-6]。原發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(分離成單個(gè)細(xì)胞)在無(wú)血清培養(yǎng)基和神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、EGF和B27中進(jìn)行原代培養(yǎng)，顯示0.3%～25.1%的膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤級(jí)別愈高越能夠繼續(xù)增殖，并隨著時(shí)間的推移在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)。這些神經(jīng)球形成的細(xì)胞，即神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，它表達(dá)的標(biāo)記物主要有巢蛋白Nestin和CD133。本研究中用巢蛋白Nestin和CD133抗體進(jìn)行免疫熒光染色，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。

表1 CD133+細(xì)胞的純度 %

A曲線是分選之前CD133+的百分比，B曲線是分選之后CD133+的百分比

圖6原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞總?cè)褐蠧D133+百分比

巢蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的第Ⅵ類中間絲蛋白，表達(dá)豐富，能夠特異性地表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞上的一種細(xì)胞標(biāo)記物，也被廣泛用作神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物檢測(cè)。在正常的細(xì)胞變成腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中，巢蛋白的表達(dá)受其內(nèi)在的細(xì)胞基因調(diào)控元件和激素受體-配基復(fù)合物以及轉(zhuǎn)錄因子等因素調(diào)控，可能對(duì)神經(jīng)元的分化有作用。巢蛋白已經(jīng)在原發(fā)的中樞神經(jīng)腫瘤中檢測(cè)到，而轉(zhuǎn)移癌中則沒(méi)有[7]。本研究對(duì)懸浮的細(xì)胞球進(jìn)行了免疫熒光染色檢測(cè)，結(jié)果顯示Nestin染色陽(yáng)性，說(shuō)明所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)了Nestin，因此證明培養(yǎng)中的懸浮細(xì)胞具有干細(xì)胞源性。

CD133是干細(xì)胞表面抗原的一種，是一種糖蛋白，最早在造血干細(xì)胞中找到這種抗原，隨后發(fā)現(xiàn)在許多實(shí)體腫瘤中如結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌、骨肉瘤以及腦腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)[8]。許多研究表明，CD133可被用作神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的共有細(xì)胞標(biāo)記物，是目前在人類膠質(zhì)瘤干細(xì)胞研究最多和經(jīng)常使用的標(biāo)記，被認(rèn)為是神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞最重要的標(biāo)記物。CD133細(xì)胞分為CD133+和CD133-細(xì)胞兩種，CD133+細(xì)胞在腫瘤中的比例與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新復(fù)制能力、致瘤能力、分化能力、耐藥以及耐放化療能力，而CD133-神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞則沒(méi)有這方面的能力[9]，因此對(duì)研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有很好的指導(dǎo)作用和研究前景。本實(shí)驗(yàn)在做流式細(xì)胞儀檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞時(shí)基本大部分為CD133+細(xì)胞，而CD133-細(xì)胞則很少或沒(méi)有，由此說(shuō)明CD133+細(xì)胞具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)能力，CD133+細(xì)胞的數(shù)量可能與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)的，其比例越高，預(yù)后則越差。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與正常的神經(jīng)干細(xì)胞之間有許多相似之處。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表達(dá)了標(biāo)記物CD133，巢蛋白Nestin，Sox2MELK等等，所有這些在成人神經(jīng)干細(xì)胞中也表達(dá)了。此外CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在培養(yǎng)中能夠增殖形成神經(jīng)球，與在相同培養(yǎng)條件下正常神經(jīng)干細(xì)胞一樣，而貼壁在培養(yǎng)皿的CD133-神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞沒(méi)有增殖形成神經(jīng)球體[10]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和正常干細(xì)胞的一個(gè)共同特征是都具有自我復(fù)制更新功能。另一個(gè)的共同點(diǎn)是具有多分化潛能性。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞究其來(lái)源，多數(shù)學(xué)者們認(rèn)為其源于發(fā)生基因突變的神經(jīng)干細(xì)胞[11]。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞同樣都表達(dá)了細(xì)胞標(biāo)記物CD133，巢蛋白Nestin。本實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色，檢測(cè)結(jié)果顯示Nestin、CD133染色陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)胞球表達(dá)了細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、CD133，所以還不能完全肯定該細(xì)胞就是神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，有可能是神經(jīng)干細(xì)胞，只是初步認(rèn)為該細(xì)胞為神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，本研究對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行染色體核型檢查及分析最終鑒定該細(xì)胞為人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。

免疫磁珠分選法是目前最新的針對(duì)CD133+細(xì)胞的分選方法，利用磁力學(xué)的原理將目標(biāo)細(xì)胞(CD133+細(xì)胞)進(jìn)行分離出來(lái)，而且所選用的磁珠也是目前被廣為接受的復(fù)合磁珠，即磁珠標(biāo)記結(jié)合的CD133抗體，在傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)中需要將磁珠與CD133抗體進(jìn)行結(jié)合，這種復(fù)合磁珠既加快了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，又提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。通過(guò)免疫磁珠分選法成功分離得到高純度的CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)上具有很強(qiáng)的可行性，受外部條件影響較小，分離得到的純度也很高，相比較其他如條件培養(yǎng)等分離方法更易獲得目標(biāo)細(xì)胞。但是目前在購(gòu)買(mǎi)實(shí)驗(yàn)試劑和高新儀器上，如熒光染色劑結(jié)合的特異性抗體、免疫磁珠分選系統(tǒng)以及分離所選用的磁珠標(biāo)記結(jié)合的CD133抗體價(jià)格較貴，實(shí)驗(yàn)研究的投入相對(duì)較大。

本實(shí)驗(yàn)從免疫熒光染色和染色體核型檢查及分析上對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，后期將從基因水平的檢測(cè)來(lái)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行深入研究。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究還有許多需要解決的問(wèn)題，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的起源問(wèn)題、特異性標(biāo)志，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞運(yùn)用到臨床上治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤等等。針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究，大部分還處在實(shí)驗(yàn)研究階段的早期，更深入地研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性非常必要，研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞將為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新的途徑。