頤腦解郁方對(duì)抑郁大鼠PI-3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

，瑞珍，子珺，

抑郁癥是指以情緒低落、興趣減退以及思維遲滯等為主要特征的精神情感類疾病，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率以及自殺率高等特點(diǎn)[1]。此病給病人家庭以及社會(huì)帶來(lái)了諸多負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)并不十分明確，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究有利于進(jìn)一步深化對(duì)抑郁癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI-3K/Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是由PI-3K和Akt組成的一條重要的抗細(xì)胞凋亡/促增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。蛋白激酶 B(protein kinase，PKB/Akt)作為PI-3K主要下游效應(yīng)分子，磷酸化后可從胞膜脫離，進(jìn)入胞漿或胞核內(nèi)，進(jìn)而參與多種生物效應(yīng)，與抑郁癥發(fā)生有關(guān)[3]?，F(xiàn)階段抑郁癥的西醫(yī)治療效果不佳，而中醫(yī)學(xué)在治療抑郁癥狀以及改善西藥副作用方面療效顯著。益腎調(diào)氣中藥頤腦解郁方無(wú)論是基礎(chǔ)研究還是臨床治療抑郁障礙均收效滿意[4-6]。本研究擬通過(guò)孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)知性溫和刺激(CUMS)建立抑郁動(dòng)物模型，采用中藥頤腦解郁方進(jìn)行干預(yù)，觀察抑郁大鼠腦內(nèi)PI-3K、Akt表達(dá)的變化，旨在探討益腎調(diào)氣中藥頤腦解郁方對(duì)抑郁大鼠的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠32只，6月齡，體質(zhì)量(210±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證：SCXK(京)2016-0006。大鼠適應(yīng)性預(yù)養(yǎng)1周，自由攝食和飲水，動(dòng)物房室溫(23±1)℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照周期晝夜各12 h(07：00～19：00光照；19：00至第2天07：00黑暗)，室內(nèi)安靜。

1.2 藥物 中藥頤腦解郁方，方藥組成：刺五加、梔子、五味子等，購(gòu)于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房，配方顆粒北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。西藥鹽酸氟西汀[禮來(lái)(蘇州)制藥有限公司]。灌胃劑量按照成人常用量20mg/(60 kg·d)的7倍計(jì)算大鼠用量0.233 mg/(100 g·d)，大鼠灌胃前先將中藥溶于蒸餾水，混勻，濃度為0.233 mg/mL。按照灌胃劑量溶解藥物，濃度每1 mL含生藥0.62 g，4 ℃冰箱冷藏備用，使用前加熱。

1.3 主要試劑及儀器 戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)BW0336)，β-actin(國(guó)產(chǎn))，三羥甲基氨基甲烷(Tris，日本)，乙二胺四乙酸(ED-TA)，苯甲基磺酰氟(PMSF，美國(guó)Sigma公司)，去氧膽酸鈉(美國(guó)Sigma公司)，考馬斯亮藍(lán)(美國(guó)Sigma公司，G-250)，溴酚藍(lán)指示劑(Bromophenol Blue，美國(guó)Sigma公司)，丙烯酰胺(國(guó)產(chǎn))，甲叉雙丙烯酰胺(國(guó)產(chǎn))，HRP標(biāo)記的二抗(國(guó)產(chǎn))，顯色試劑(ECL Prime Western Biotting Det，貨號(hào)RPN2232)，硝酸纖維素膜(NC膜)，顯影粉(XYF002)，定影粉(DYF001)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，蛋白Maker，PI-3K一抗(CST，美國(guó))，Akt一抗(CST，美國(guó))，電子天平(珠恒電子有限公司，型號(hào)JCS-11002A)。自制大鼠束縛架，自制大鼠夾尾夾，自制冰水游泳實(shí)驗(yàn)水箱，水浴鍋，組織勻漿器，超聲裝置，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(HP-960型美國(guó))，低溫離心機(jī)(Beckman日本)，電泳儀(BIO-RAD，美國(guó))，濕轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD，美國(guó))，酸度計(jì)(HI9321HANNA，Italy)，脫色搖床(TS-1型，江蘇)，層析冷柜(YC-1北京)，F(xiàn)luorchem圖像分析系統(tǒng)(美國(guó))。

1.4 模型制備 抑郁模型采用孤養(yǎng)聯(lián)合21 d慢性不可預(yù)知性溫和刺激建立抑郁模型[7-8]。即單籠飼養(yǎng)進(jìn)行為期3周的應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)選取7種應(yīng)激方法，包括禁食24 h、禁水24 h、潮濕墊料24 h、夾尾1 min、鼠籠傾斜45° 24 h、4 ℃冰水游泳5 min、束縛3 h這7種方法，每天嚴(yán)格按照表格方案應(yīng)用其中一種刺激方法，每種方法使用3次。詳見(jiàn)表1。

表1 抑郁大鼠21 d抑郁造模方法安排表

1.5 分組及給藥 購(gòu)入大鼠適應(yīng)性預(yù)養(yǎng)1周后，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，選擇評(píng)分相近的大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥治療組及西藥治療組，每組8只大鼠。正常組不予干預(yù)，常規(guī)飼養(yǎng)，其余組于應(yīng)激結(jié)束后藥物干預(yù)6周。中藥組灌胃中藥頤腦解郁方，西藥組灌胃鹽酸氟西汀，模型組灌胃蒸餾水，根據(jù)體質(zhì)量變化每周調(diào)整灌胃量，連續(xù)灌胃42 d。取材前1 d禁食不禁水24 h，各組取8只大鼠， 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭取腦，冰盤上快速分離右側(cè)前額葉皮質(zhì)及海馬，微量稱稱取80 mg，迅速放入標(biāo)記好分組的EP管并暫時(shí)液氮速凍，待取材結(jié)束后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Western-blot檢測(cè) 取出凍存前皮質(zhì)及海馬，分別加入組織裂解液，電動(dòng)勻漿，離心，變性處理，制成蛋白質(zhì)樣品，以紫外線分光光度計(jì)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。步驟如下：經(jīng)過(guò)灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，將膜裝入5%脫脂奶粉封閉液，制置室溫?fù)u床上持續(xù)搖動(dòng)2 h；加一抗(Akt 1∶800；PI 3K 1∶500)，于4 ℃冰箱過(guò)夜；然后加入濃度為1∶2 000偶聯(lián)有辣根過(guò)氧化物酶的羊抗兔IgG，置室溫下?lián)u床上持續(xù)搖動(dòng)2 h；最后顯色(ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)，曝光，顯影，定影。采用Fluorchem圖像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白帶的光密度，進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 抑郁大鼠腦內(nèi)Akt的表達(dá) 經(jīng)Western-blot蛋白印跡方法測(cè)定顯影后，獲得β-actin條帶和分子量為60 kD的深色條帶。詳見(jiàn)圖1。模型組大鼠前額葉皮質(zhì)層Akt表達(dá)與正常組相比明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，海馬Akt表達(dá)與正常相比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)藥物干預(yù)后，中藥治療組及西藥治療組大鼠海馬及皮質(zhì)層Att表達(dá)下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

1為正常組；2為模型組；3為中藥治療組；4為西藥對(duì)照組圖1 各組大鼠皮質(zhì)及海馬Akt表達(dá)

表2 各組大鼠海馬及皮質(zhì)層Akt表達(dá)相對(duì)量比較(±s)

2.2 抑郁大鼠腦內(nèi)PI-3K的表達(dá) 經(jīng)Western-blot蛋白印跡方法測(cè)定顯影后，獲得分子量為85 kD的目的蛋白。詳見(jiàn)圖2。模型組海馬及皮質(zhì)內(nèi)的PI-3K表達(dá)明顯升高，與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)藥物治療后，中藥治療組和西藥治療組大鼠海馬、皮質(zhì)PI-3K表達(dá)下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

1為正常組；2為模型組；3為中藥治療組；4為西藥治療組圖2 各組大鼠腦內(nèi)PI-3K表達(dá)

表3 各組大鼠海馬及皮質(zhì)內(nèi)Akt表達(dá)相對(duì)量比較(±s)

3 討 論

PI-3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是蛋白激酶偶聯(lián)受體介導(dǎo)的一條重要抗凋亡/促增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3K或PI-3K)是該通路的中心環(huán)節(jié)，其配體與受體結(jié)合后，PI-3K通過(guò)其p85亞單位與活化的受體結(jié)合，使其p110亞單位被受體磷酸化而活化[9]。另PI-3K可催化PIP3產(chǎn)生，并通過(guò)結(jié)合蛋白激酶B(PKB，為原癌基因C-akt的產(chǎn)物，又稱為Akt)的PH結(jié)構(gòu)域，將其錨定于質(zhì)膜而活化。Akt作為該通路上的另一重要效應(yīng)分子，是 PI-3K 的主要下游靶目標(biāo)，可磷酸化多種蛋白，而從介導(dǎo)細(xì)胞代謝以及存活等效應(yīng)[10-11]。研究表明PI-3K信號(hào)通路與抑郁癥密切相關(guān)[12- 13]，不僅可以通過(guò)下游的內(nèi)皮型-氧化氮合酶(eNOS)/NO/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)途徑調(diào)節(jié)血管舒縮功能，調(diào)節(jié)腦血流量，改善學(xué)習(xí)記憶能力，還可以被激活，促進(jìn)關(guān)鍵蛋白PI-3K及Akt的磷酸化上調(diào)釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)來(lái)抵抗神經(jīng)元損傷，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)與再生[3， 14]。Martin等[15]研究表明，抑郁不僅伴隨炎癥，還伴有多種氧化應(yīng)激途徑的誘導(dǎo)。神經(jīng)炎癥反應(yīng)是抑郁癥神經(jīng)血管單元失穩(wěn)態(tài)的重要病理環(huán)節(jié)。中藥靶向神經(jīng)炎癥反應(yīng)補(bǔ)腎以固其本，提高神經(jīng)血管單元自穩(wěn)調(diào)節(jié)能力，防止炎癥因子及代謝物之積聚，以通絡(luò)解郁[16]。另有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)認(rèn)為 PI-3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常導(dǎo)致的BDNF分泌的減少是抑郁癥發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[17]。應(yīng)激是引起細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常的重要原因之一，本研究采用21 d慢性不可預(yù)知性溫和刺激建立抑郁大鼠模型腦內(nèi)表現(xiàn)為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子PI-3K及下游重要效應(yīng)分子Akt表達(dá)的升高，可能與氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子以及BDNF減少等多種因素引起的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)，海馬以及皮質(zhì)神經(jīng)元受損而功能缺失，進(jìn)而大鼠表現(xiàn)出記憶減退及情緒障礙。

本研究發(fā)現(xiàn)抑郁模型大鼠腦海馬及前額葉皮質(zhì)存在PI-3K及Akt表達(dá)的升高，采用益腎調(diào)氣中藥頤腦解郁方進(jìn)行干預(yù)后，大鼠腦內(nèi)PI-3K及Akt表達(dá)下降，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子是重要的藥物作用靶位，益腎調(diào)氣中藥頤腦解郁方的抗抑郁作用可能與下調(diào)PI-3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低PI-3K、Akt的表達(dá)，阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減少神經(jīng)元受損有關(guān)。