基于響應(yīng)面法對白地霉M5高產(chǎn)酯發(fā)酵工藝優(yōu)化

田宇敏，賈麗艷,*，高娟娟，郭晉田，王軍燕，甄曉君

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 汾陽 032209；3.山西潞城市圣堂食品有限公司，山西 潞城 047500)

食醋，作為歷史悠久的傳統(tǒng)調(diào)味品深受廣大消費者的喜愛。作為調(diào)味品，食醋的風(fēng)味在很大程度上決定了食醋的品質(zhì)[1]。影響食醋風(fēng)味的物質(zhì)種類豐富，包括酸、酯、醇、酮、吡嗪等。其中酯對于食醋的風(fēng)味有重要影響，是食醋品質(zhì)優(yōu)劣的主要考察指標(biāo)之一[2]。主要的酯類包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、醋酸苯乙酯及乙酸丁酯等[3]，能夠賦予食醋果香和乳香等特殊香氣。因此，對食醋中酯類物質(zhì)含量及組成的調(diào)控具有重要意義。

國內(nèi)外研究者對食醋的風(fēng)味進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)微生物菌種在傳統(tǒng)釀造食品中起著決定性的作用[4]。白地霉(Geotrichumcandidum)是一類形態(tài)特征介于酵母菌和霉菌之間的真核微生物[5]。近年來，針對白地霉的產(chǎn)香特性，國內(nèi)外有很多應(yīng)用白地霉作為商品的報道，如：香精香味添加劑[6,7]、奶酪的后熟發(fā)酵[8,9]、菜籽油[10]、啤酒等[11]，但在食醋方面的研究甚少。本課題組從酒醅中分離得到1株具有高產(chǎn)酯能力并產(chǎn)特殊香氣成分的白地霉M5，通過采用HS-SPME-GC-MS分析其固態(tài)發(fā)酵主要香氣成分，檢測出多種物質(zhì)具有食醋的特征香氣成分，包括苯乙醇、乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、2-甲基丁酸、苯乙醛、月桂酸乙酯等，具有應(yīng)用于食醋發(fā)酵并提高食醋品質(zhì)的潛能。本研究在此基礎(chǔ)上，以高粱為原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，通過單因素及Plackett-Burman試驗篩選主要影響因子，并采用Box-Benhnken設(shè)計建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行響應(yīng)面試驗，探究白地霉M5產(chǎn)酯發(fā)酵的最佳工藝條件，以期為其應(yīng)用于食醋等傳統(tǒng)食品的釀造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

菌株M5：分離自新鮮酒醅。

培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基[12]。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：原料100 g粉碎后滅菌，加入適量糖化酶制備成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。

試劑：氫氧化鈉、硫酸、乙酸、乙醇等，以上試劑均為AR級。

1.2 儀器與設(shè)備

25 mL堿式滴定管；25 mL酸式滴定管；250 mL錐形瓶；移液管；全玻璃回流裝置；ST3100實驗室pH計 奧豪斯儀器有限公司；B11-3恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；DL-1萬用電爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；JJ124BC型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 產(chǎn)酯能力的測定

采用改進(jìn)的電位滴定法。

2.2 總酯的測定

采用皂化回流法，參照GB/T 13662-2008[13]。

2.3 單因素試驗

以總酯含量為測定指標(biāo)，研究搖床轉(zhuǎn)速、接種菌齡、發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度、接種量等因素對白地霉M5固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯的影響。

2.3.1 接種菌齡對總酯含量影響的測定

將搖床轉(zhuǎn)速120 r/min活化后的白地霉M5以9.0%(V/m)的接種量接入高粱固態(tài)培養(yǎng)基中，在菌齡分別為12，24，36，48，60 h，28 ℃條件下培養(yǎng)7天，測定其總酯含量，探究接種菌齡對白地霉M5產(chǎn)酯含量的影響。

2.3.2 搖床轉(zhuǎn)速對總酯含量影響的測定

將活化后菌齡為24 h的白地霉M5以9.0%(V/m)接種量接入高粱固態(tài)培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)7天，菌液搖床轉(zhuǎn)速分別為90，120，150，180 r/min，測定其總酯含量，探究搖床轉(zhuǎn)速對白地霉M5產(chǎn)酯含量的影響。

2.3.3 發(fā)酵時間對總酯含量影響的測定

將活化后菌齡為24 h、搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min的白地霉M5以9.0%(V/m)的接種量接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下培養(yǎng)3，5，7，9，11天，測定其總酯含量，探究發(fā)酵時間對白地霉M5產(chǎn)酯含量的影響。

2.3.4 培養(yǎng)溫度對總酯含量影響的測定

將活化后菌齡為24 h、搖床轉(zhuǎn)速的120 r/min的白地霉M5以9.0%(V/m)的接種量接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在25，28，31，34，37 ℃條件下培養(yǎng)7天，測定其總酯含量，探究培養(yǎng)溫度對白地霉M5產(chǎn)酯含量的影響。

2.3.5 接種量對總酯含量影響的測定

將活化后菌齡為24 h、搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min的白地霉M5分別以接種量為5%，7%，9%，11%，13% (V/m)接入高粱固態(tài)培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)7天，測定其總酯含量，探究接種量對白地霉M5產(chǎn)酯含量的影響。

2.4 Plackett-Burman(PB)法篩選試驗

根據(jù)試驗設(shè)計的要求，在單因素試驗的基礎(chǔ)上對影響白地霉M5總酯產(chǎn)量的5個主要研究因素接種菌齡、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度、接種量等進(jìn)行PB試驗，見表1。

表1 因子篩選試驗因素水平表

2.5 白地霉M5產(chǎn)酯發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Plackett-Burman試驗確定發(fā)酵條件各因素的影響順序，選取前3個顯著因子(接種菌齡、搖床轉(zhuǎn)速、接種量)為主要影響因素，以總酯含量為響應(yīng)值設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗(見表2)，得出其最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。

表2 響應(yīng)面分析的因素水平

3 結(jié)果與分析

3.1 白地霉M5的產(chǎn)酯化能力

表3 不同培養(yǎng)基的酯化酶活力比較

由表3可知，白地霉M5在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)酯能力有明顯差異。相較于麩皮固態(tài)培養(yǎng)基，在高粱固態(tài)培養(yǎng)基上產(chǎn)酯能力更加顯著，100 mL樣品中乙酸乙酯濃度高達(dá)323.84 mol/L，說明該菌株的產(chǎn)酯能力極強。且與其他菌株相比較[14]，白地霉M5的產(chǎn)酯能力較高。

3.2 單因素試驗

3.2.1 接種菌齡對總酯含量的影響

圖1 接種菌齡對總酯含量的影響

由圖1可知，隨著接種菌齡的增加，總酯含量呈現(xiàn)先緩慢增加后逐漸減少的趨勢。當(dāng)接種菌齡達(dá)到24 h時，總酯含量達(dá)到最大值，為3.22 g/dL；當(dāng)接種菌齡大于24 h時，總酯含量緩慢降低，酯類物質(zhì)慢慢減少。由于白地霉M5菌齡在24 h達(dá)到對數(shù)期，可能導(dǎo)致24 h后隨著菌齡的增加，菌株M5的產(chǎn)酯能力變?nèi)?。故白地霉M5產(chǎn)酯發(fā)酵的最佳接種菌齡為24 h。

3.2.2 搖床轉(zhuǎn)速對總酯含量的影響

與靜置發(fā)酵相比較，不同搖床轉(zhuǎn)速的發(fā)酵會增加菌株生長繁殖的能力[15]。

圖2 搖床轉(zhuǎn)速對總酯含量的影響

由圖2可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，白地霉M5的總酯含量明顯呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到150 r/min時，總酯含量達(dá)到最大值，為3.19 g/dL；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速大于150 r/min時，產(chǎn)酯量下降，其原因可能是振蕩過快、通氣量太大使酵母呼吸旺盛，從而加速了酯的分解，使得該菌株的產(chǎn)酯能力隨之下降[16]。由此可知，菌株M5產(chǎn)酯發(fā)酵的過程需要一定量的空氣，不宜過多。因此，白地霉M5產(chǎn)酯發(fā)酵的最佳搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。

3.2.3 發(fā)酵時間對總酯含量的影響

圖3 發(fā)酵時間對總酯含量的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的增加，總酯含量呈緩慢上升后大幅度下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間為7天時，總酯含量達(dá)到最大值，為3.22 g/dL；當(dāng)發(fā)酵時間大于7天時，該菌株的總酯含量下降，造成以上現(xiàn)象的原因可能是發(fā)酵時間過長導(dǎo)致培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，發(fā)酵過程中的風(fēng)味發(fā)生變化，甚至出現(xiàn)酸敗現(xiàn)象[17]。因此，白地霉M5產(chǎn)酯的最佳發(fā)酵時間為7天。

3.2.4 接種量對總酯含量的影響

圖4 接種量對總酯含量的影響

由圖4可知，隨著接種量的提高，白地霉M5的總酯含量明顯呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)接種量達(dá)到11%(V/m)時，總酯含量達(dá)到最大值,為3.28 g/dL；當(dāng)接種量高于11%(V/m)時，該菌株的產(chǎn)酯量呈下降趨勢，可能是由于接種量過高，導(dǎo)致固態(tài)培養(yǎng)基在發(fā)酵中營養(yǎng)物質(zhì)過快得消耗，較多的代謝產(chǎn)物和次代謝產(chǎn)物抑制了菌株的生長和產(chǎn)酯的能力。故白地霉M5產(chǎn)酯發(fā)酵的最佳接種量為11%(V/m)。

3.2.5 培養(yǎng)溫度對總酯含量的影響

圖5 培養(yǎng)溫度對總酯含量的影響

由圖5可知，不同的培養(yǎng)溫度對白地霉M5的總酯含量有不同影響。培養(yǎng)溫度在25～34 ℃時，總酯含量變化不大；當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時，總酯含量達(dá)到最大值，為3.26 g/dL；而培養(yǎng)溫度高于34 ℃后，該菌株的產(chǎn)酯量呈大幅度下降趨勢，可能是由于溫度過高抑制了菌株的生長和產(chǎn)酯能力。故白地霉M5產(chǎn)酯發(fā)酵的最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃。

3.3 PB試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用因子篩選試驗進(jìn)行顯著因子的篩選，采取分組為12組，水平為2的試驗設(shè)計，對接種菌齡(A)、搖床轉(zhuǎn)速(B)、發(fā)酵時間(C)、接種量(D)、培養(yǎng)溫度(E)5個因素進(jìn)行考察，試驗設(shè)計與結(jié)果見表4。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)，擬合得到的方程：總酯含量=3.09933+0.03033A-0.04650B+0.00950C-0.05083D+0.01800E。通過Minitab17軟件進(jìn)行方差分析可知，在研究的整體回歸區(qū)域內(nèi)，該模型的擬合性比較好，判定系數(shù)為R2=0.9241，說明影響總酯含量的主要因素篩選試驗中，92.41%的數(shù)據(jù)可由該模型解釋說明，試驗結(jié)果準(zhǔn)確。

表5 Plackett-Burman試驗方差分析

根據(jù)試驗結(jié)果的方差分析，由表5可知，3個因素P(A)=0.016、P(B)=0.002、P(D)=0.001其P值均小于0.05。因此，選擇接種菌齡、搖床轉(zhuǎn)速和接種量進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

3.4 響應(yīng)面法試驗結(jié)果

3.4.1 響應(yīng)面法試驗結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計是通過因子篩選的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的設(shè)計方案優(yōu)化，根據(jù)3.2的篩選結(jié)果得出3個顯著因子，即接種菌齡(A)、搖床轉(zhuǎn)速(B)、接種量(C)，見表6。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計的響應(yīng)面試驗結(jié)果進(jìn)行多元化回歸擬合分析，得出菌株M5固態(tài)發(fā)酵的總酯含量(Y)與接種菌齡(A)、搖床轉(zhuǎn)速(B)、接種量(C)3個因素變量的二次方程模型為：

Y=3.13+0.012A-8.487E-003B+0.012C-6.500E-004AB+2.750E-004AC-0.011BC-0.062A2-0.091B2-0.041C2。

表7 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

續(xù) 表

注：“**”表示極顯著(P<0.01)，“*”表示顯著(0.01

由表7可知，模型的失擬項P=0.0757>0.05，結(jié)果不顯著，表明回歸方程不失擬，可反映3個因素與響應(yīng)值間的真實關(guān)系；回歸模型P<0.0001<0.01，說明模型極顯著，表明試驗設(shè)計的可靠性；模型的回歸決定系數(shù)R2=0.9916，表明響應(yīng)值的變化有99.16%來源于所選因素的變化，且該模型能夠較好地擬合試驗結(jié)果；預(yù)測Pred-R2=0.8908也能合理地說明校正決定系數(shù)Radj2=0.9809值的變化。另外，A和C對Y影響極顯著，B對Y影響顯著，且A和C均為正效應(yīng)，二次項AB和BC對Y均為負(fù)效應(yīng)，說明影響菌株M5固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)總酯含量3個因素之間對發(fā)酵工藝沒有明顯的交互作用；A2，B2和C2對Y影響極顯著，這說明接種菌齡、搖床轉(zhuǎn)速和接種量3個因素都是在發(fā)酵產(chǎn)酯過程中需要主要控制的因素。綜上所述，各因素對總酯含量的影響不是簡單點線性關(guān)系。

應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1的Optimization對菌株M5固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)酯條件優(yōu)化，其結(jié)果與微分法所得結(jié)果一致，且僅有一種優(yōu)化方案，模型擬合合理。得知的3個自變量最優(yōu)真實值為：接種菌齡24 h、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min和接種量11%，其預(yù)測的總酯含量可達(dá)到3.1301 g/dL。

3.4.2 白地霉M5產(chǎn)酯發(fā)酵條件的響應(yīng)面分析及等高線

響應(yīng)面圖形分析可以直觀地反映出各因素和它們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響，利用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得的二次回歸方程的響應(yīng)面圖及等高線見圖6～圖8。

圖6 接種菌齡與搖床轉(zhuǎn)速交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖7 接種菌齡與接種量交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖8 搖床轉(zhuǎn)速與接種量交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

根據(jù)各因素之間兩兩相互作用的響應(yīng)面圖形觀察，各因素間的交互作用較為強烈，由此可知曲線走勢越險抖，其影響越顯著；曲線走勢越平緩，其影響越小。曲面的形式變化反映響應(yīng)值的變化大小。由圖6～圖8可知，A，B，C 3個響應(yīng)因素在選定范圍內(nèi)都存在極值即響應(yīng)面頂點，其中BC交互作用是較顯著的，AB、AC交互作用不顯著。

3.5 響應(yīng)面驗證性試驗

利用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗，通過優(yōu)化得出：接種菌齡為24 h、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、接種量為11%(V/m)，得到的最佳總酯含量3.1301 g/dL。為驗證上述結(jié)果的可靠性，在此最優(yōu)條件下對菌株M5進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，做3次平行試驗，得到的實際平均值總酯含量：(3.1301±0.0047) g/dL，與Box-Behnken模型具有較高一致性，故得到的模型能夠較好預(yù)測白地霉M5固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯條件及總酯含量，具有可靠的現(xiàn)實意義。

4 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上對影響白地霉M5固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯因素進(jìn)行PB試驗，經(jīng)過篩選得到3個顯著因子，分別為接種菌齡(P=0.0063<0.01)、搖床轉(zhuǎn)速(P=0.0327<0.05)、接種量(P=0.0072<0.01)。根據(jù)PB試驗篩選出的3個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗，最終得到發(fā)酵最佳工藝為：接種菌齡為24 h、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、發(fā)酵時間7天、接種量為11%(V/m)、培養(yǎng)溫度28 ℃，總酯含量為3.1301 g/dL，比原總酯含量提高了56%。綜上所述，白地霉M5具有高產(chǎn)酯能力，為后期應(yīng)用于食醋的釀造、提高食醋的品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。