膠體金免疫層析技術(shù)在食源性致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

孔玉方，王慧煜，韓雪清

(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 大興100176)

隨著人們生活水平的提高,肉、蛋、奶類在人們?nèi)粘２妥郎铣霈F(xiàn)的數(shù)量猛增。因此,動(dòng)物食品安全問題成為我國市場(chǎng)監(jiān)督管理部門關(guān)注的重點(diǎn)。很多家畜因感染某些疾病,致使肉、蛋、奶中帶入傳染源,此類疾病傳染性強(qiáng),危害大,嚴(yán)重威脅人類健康。因此,早期快速檢測(cè)對(duì)預(yù)防控制此類疾病的發(fā)生發(fā)展具有重大意義。膠體金免疫層析技術(shù)由于標(biāo)記物制備簡(jiǎn)單、方法敏感、特異,不需要使用任何放射性同位素,應(yīng)用范圍廣,如病原體、藥物、激素、代謝物檢測(cè)及飼料/食品和環(huán)境指標(biāo)的監(jiān)測(cè)[1]。該技術(shù)在食源性傳染病檢測(cè)方面的相關(guān)報(bào)道較少,因此本文就膠體金免疫層析技術(shù)在常見食源性傳染病檢測(cè)中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 膠體金免疫層析技術(shù)

1.1 膠體金層析技術(shù)原理 膠體金免疫層析技術(shù)(Colloidal gold immunochroma-tography assay,GICA)是一種以膠體金作為標(biāo)記物應(yīng)用于檢測(cè)特定抗原或抗體的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷,可與帶正電荷集團(tuán)的蛋白質(zhì)分子牢固結(jié)合,由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合,所以對(duì)蛋白質(zhì)的生物特性不會(huì)產(chǎn)生任何影響。除蛋白質(zhì)外膠體金還可以與其他生物大分子結(jié)合,如ConA、PHA、SPA 等。膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)主要利用了顆粒金具有高電子密度的特性,在金標(biāo)蛋白結(jié)合處,在顯微鏡下可見黑褐色顆粒,當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí),肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn),因此可用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中[2]。該技術(shù)成為繼酶標(biāo)記、熒光素和放射性同位素技術(shù)之后的又一重要的現(xiàn)代新型免疫標(biāo)記技術(shù)。GICA技術(shù)已經(jīng)成為目前檢測(cè)食源性傳染病致病菌最快速、敏感和特異的免疫學(xué)檢測(cè)方法之一。

1.2 膠體金免疫層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 近年來發(fā)展起來的免疫分析法、基因生物芯片、生物傳感器和PCR 等檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于常見食源性傳染病中。其中GICA 技術(shù)操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、檢測(cè)范圍廣,不需要儀器設(shè)備檢測(cè)；檢測(cè)速度快,一般在5 ～15 min 就可得到肉眼可見的結(jié)果,可用于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的檢測(cè)和流行病普查；GICA 試紙條穩(wěn)定性好,室溫可保存12 ～24 個(gè)月,檢測(cè)結(jié)果室溫下保存時(shí)間較長；GICA 試紙條在臨床檢驗(yàn)中可用于檢測(cè)尿、唾液、全血、血清、血漿、體液等樣品僅需簡(jiǎn)單處理或不處理即可檢測(cè),且樣品用量極少。鑒于上述GICA 試紙條的優(yōu)點(diǎn),該技術(shù)比較適合食源性暴發(fā)流行病的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢驗(yàn)等[3]。

2 膠體金免疫層析技術(shù)在病原生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 病原微生物方面的檢測(cè)

2.1.1 細(xì)菌疾病 布魯菌病是一種急慢性食源性人獸共患傳染病,人主要通過接觸病畜的流產(chǎn)物、乳、肉、皮毛而感染,當(dāng)人的機(jī)體免疫力下降時(shí),病原菌就會(huì)進(jìn)入血液,形成菌血癥。目前膠體金免疫層析技術(shù)由于標(biāo)記物制備簡(jiǎn)單,檢測(cè)速度快、敏感性高和樣品用量極少的優(yōu)點(diǎn),被廣泛的應(yīng)用到食源性傳染病的檢測(cè)中。董浩等[4]采用GICA 和虎紅平板凝集試驗(yàn)(RPST)對(duì)牛血清和羊血清進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果GICA 檢測(cè)法敏感性高于RPST 法,可有效的應(yīng)用于家畜布病初篩試驗(yàn)當(dāng)中?？子穹降萚5]將布魯菌病表達(dá)純化的OMP22 和OMP28 重組蛋白作為檢測(cè)抗原,膠體金表面標(biāo)記OMP22 和OMP28,制備膠體金免疫層析試紙條分別檢測(cè)牛、羊血清各100 份,與虎紅平板凝集試驗(yàn)和ELISA 試劑盒的檢測(cè)結(jié)果符合率分別為97.4%和95%,檢測(cè)布魯菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的最低稀釋度達(dá)1∶128。結(jié)果表明,該試紙條敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌引發(fā)的一種人獸共患慢性傳染病,牛是該病的易感動(dòng)物,人多因食用感染病牛的牛奶、奶制品和肉類等而感染。人結(jié)核與牛結(jié)核可相互感染,禽結(jié)核也可感染牛和人。人感染結(jié)核后,治療不及時(shí)極易造成患者死亡。牛結(jié)核病的流行傳染,縮短了奶牛的壽命,產(chǎn)奶量逐漸降低,母牛的受孕率降低。,GICA 在預(yù)防此類疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重大作用。Mduli 等[6]和Wassie 等[7]制備能夠檢測(cè)人結(jié)核分枝桿菌的GICA 試紙條,該試紙條具有較好的檢測(cè)效果。李霜君等[8]采用GICA 法檢測(cè)結(jié)核病患者和健康人血清樣本中的特異性結(jié)核抗體IgG/IgM,結(jié)果該方法檢測(cè)特異性結(jié)核抗體IgG/IgM 的特異性為91.67%,可用于結(jié)核病的篩查。

沙門菌病是由革蘭陰性桿菌引發(fā)的一種常見食源性人獸共患病,人在食用被沙門菌污染的食物12 ～72 h 后,短時(shí)間內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)熱,嚴(yán)重者出現(xiàn)敗血癥或?qū)е禄颊咚劳觥Ｎ覈磕暧猩抽T菌造成的食物中毒事件占食品中毒總事件的40%～60%。因此,快速、高效的檢測(cè)沙門菌具有重要意義。劉志科等[9]研制了一種雞白痢沙門菌試紙條,檢測(cè)臨床采集的血清并用平板凝集試驗(yàn)對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與平板凝集試驗(yàn)的符合率達(dá)96.43%。劉景武等[10]研制了一種以膠體金標(biāo)記沙門菌血清抗體,用于檢測(cè)氯化鈉洛液、沙門菌、大腸桿菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、變形桿菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌等細(xì)菌,結(jié)果21 株沙門菌均為陽性而其他的檢測(cè)結(jié)果均為陰性,靈敏度為106CFU/mL。

2.1.2 病毒疾病 口蹄疫是由口蹄疫病毒引發(fā)的既可嚴(yán)重侵害家畜、野生動(dòng)物又可感染人的一種高度傳染、急性烈性熱性接觸性和復(fù)雜多變的傳染病。人通過與患病動(dòng)物直接接觸,或者接觸到帶毒氣溶膠或污染的食物,特別是被污染的牛奶而感染。林彤等[11]制備的FMDV AsiaⅠ型的膠體金試紙條,用于檢測(cè)豬水皰病病毒和FMDV 的其他血清型無交叉反應(yīng)發(fā)生,而且該試紙條與其他常規(guī)檢測(cè)方法的符合率達(dá)98.8%。Jiang 等[12]研制了一種檢測(cè)FMDV 的雙抗體夾心GICA 法,該方法檢測(cè)時(shí)間為15 min,靈敏度為11.7 ng/mL。

2.2 寄生蟲方面的檢測(cè) 旋毛蟲病是一種呈世界性分布的食源性人獸共患寄生蟲病,人多生食或半生食含有旋毛蟲幼蟲囊包的豬肉及肉制品而感染。旋毛蟲病需在橫紋肌里查找和摘取囊包幼蟲壓片鏡檢,取材困難,檢出率僅為50%左右,導(dǎo)致臨床診斷極度困難[13],秦銀霞等[14]以膠體金標(biāo)記葡萄球菌蛋白A(SPA)和旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌抗原構(gòu)建免疫層析試紙條,用于檢測(cè)旋毛蟲感染血清,結(jié)果試紙條對(duì)旋毛蟲病患者、豬血清檢測(cè)率為100%,旋毛蟲感染小鼠的檢出率為97.87%。表明試紙條實(shí)用強(qiáng)。

廣州管圓線蟲病是一種新現(xiàn)的腦內(nèi)食源性人獸共患寄生蟲病,主要侵犯人的中樞神經(jīng)。人多因生食或半生食被三期幼蟲污染的水生動(dòng)物而感染。目前,金標(biāo)病原學(xué)檢測(cè)需從患者的腦脊液或其他部位查到Ⅳ期或Ⅴ期幼蟲,才可確診,由于寄生位置特殊,致使漏診誤診率高,。郝振華等[15]建立了一種適用于基層檢測(cè)廣州管圓線蟲病的試紙條,用于檢測(cè)小鼠陽性血清抗體。結(jié)果該方法檢測(cè)的敏感性和特異性均為100%。膠體金免疫層析法有望應(yīng)用于廣州管圓線蟲病現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查和臨床快速篩查。

鏈狀帶絳蟲[Taenia solium(Linnaeus,1758)]人多因誤食生的或未煮熟的含活囊尾蚴的豬肉而感染。確診豬帶絳蟲病的免疫學(xué)診斷主要是通過檢測(cè)血清中特異性抗體,采用的抗原主要是排泄分泌抗原、囊液抗原和成蟲抗原,由于這些抗原成分復(fù)雜,獲取和純化操作比較繁瑣。張少華等[16]建立了一種以膠體金標(biāo)記豬帶絳蟲六鉤蚴重組蛋白(TSOL18)的雙抗原夾心試紙條,用于檢測(cè)豬血清樣品,結(jié)果該試紙條檢測(cè)的敏感性和特異性分別為75%和95.2%。

3 展望

膠體金免疫層析技術(shù)以其生產(chǎn)成本低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、敏感、特異,結(jié)果肉眼可觀,不需要其他設(shè)備儀器等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食源性人獸共患傳染病現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和臨床快速診斷中,成為當(dāng)今學(xué)者研究的熱點(diǎn)。但膠體金免疫層析技術(shù)尚存在不足之處,如靈敏度低,假陽性、假陰性,重復(fù)性不高和定量不準(zhǔn)確等問題。中國檢科院劉佳佳等[17]制備了一種牛布魯菌熒光標(biāo)記免疫層析試紙條,最低可檢測(cè)出1∶100 牛布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,并且與商品化的ELISA 試劑盒符合率達(dá)93.5%,表明熒光標(biāo)記的試紙條靈敏度更高。李廣強(qiáng)等[18]采用量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)布病,檢測(cè)布病抗體的敏感性為99%,特異性為95.8%。相信隨著熒光量子點(diǎn)和鑭系金屬等標(biāo)記技術(shù)的不斷成熟可有效的提高免疫標(biāo)記技術(shù)的敏感性、特異性,并實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè),定量或半定量檢測(cè)是將來該技術(shù)發(fā)展的主要趨勢(shì)。