溫敏型分子印跡量子點(diǎn)生物傳感器用于檢測(cè)牛血紅蛋白

羅愛(ài)芹，劉紅陽(yáng)，張?chǎng)危悷樈?，李園園，孫立權(quán)

(北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081)

蛋白質(zhì)作為生理功能的執(zhí)行者和生命現(xiàn)象的體現(xiàn)者，其檢測(cè)方法在生命科學(xué)的研究中具有重要意義.傳統(tǒng)的蛋白檢測(cè)技術(shù)，如蛋白芯片技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)方法、電泳法、質(zhì)譜分析方法等通常成本較高，耗時(shí)耗力，因此有必要開(kāi)發(fā)一種低成本、高效的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法.分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology, MIT)是一種制備出對(duì)模板分子具有特異性識(shí)別能力的聚合物的技術(shù)，該聚合物也稱為分子印跡聚合物(MIPs).MIPs具有較高的穩(wěn)定性，能夠承受較大的溫度、壓力和pH變化，因此在色譜填料、生物材料模擬和固相萃取等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用.目前，應(yīng)用于小分子的分子印跡技術(shù)已經(jīng)比較成熟，但很難推廣到生物大分子中，這主要是由蛋白質(zhì)分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、構(gòu)象多變、洗脫困難等原因造成的.量子點(diǎn)(quantum dots，QDs)是一種具有納米晶體結(jié)構(gòu)的半導(dǎo)體材料，他們具有獨(dú)特的光電特性，如高量子產(chǎn)率、斯托克斯位移大、光學(xué)特性穩(wěn)定[1]等.量子點(diǎn)廣泛應(yīng)用于熒光標(biāo)記和細(xì)胞成像、太陽(yáng)能電池、傳感器和光學(xué)器件等領(lǐng)域[2].將量子點(diǎn)與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，可制備基于量子點(diǎn)的分子印跡聚合物生物傳感器(QD@MIPs)，該傳感器兼具量子點(diǎn)作為熒光材料的檢測(cè)優(yōu)越性和分子印跡聚合物材料對(duì)模板蛋白的檢測(cè)分析和選擇吸附能力.此外，這種具有“核-殼”結(jié)構(gòu)的印跡聚合物在捕獲模板分子后，會(huì)由于量子點(diǎn)與模板分子之間的電子能量傳遞而導(dǎo)致量子點(diǎn)的熒光猝滅，將生物分子識(shí)別過(guò)程轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)分析.

血紅蛋白(Hb)是維持有機(jī)生命體進(jìn)行正常生理活動(dòng)的重要介質(zhì)，在氧氣和二氧化碳的輸送及維持血管系統(tǒng)血流中的pH平衡中起著關(guān)鍵作用[3].Hb在其4個(gè)分子亞基中的結(jié)構(gòu)失調(diào)可導(dǎo)致各種遺傳性疾病，例如鐮狀細(xì)胞性貧血、地中海貧血等.因此，Hb的檢測(cè)分析有著重要的意義.由于牛血紅蛋白(BHb)與人血紅蛋白有90%的相似性[4]，且價(jià)格低廉、便于獲取，故本文選用BHb代替人血紅蛋白作為目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析.實(shí)驗(yàn)通過(guò)化學(xué)共沉淀法合成硫化鋅量子點(diǎn)，并使用L-半胱氨酸進(jìn)行修飾.以L-半胱氨酸修飾硫化鋅量子點(diǎn)為印跡載體，丙烯酰胺(AAm)、甲基丙烯酸(MAA)、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)為功能單體，N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)為交聯(lián)劑，采用表面印跡技術(shù)制備了BHb的分子印跡聚合物生物傳感器(QD@MIPs).該生物傳感器靈敏度高、檢測(cè)限低、響應(yīng)時(shí)間快，還具有溫敏特性，可以在復(fù)雜的生物樣品中快速識(shí)別和檢測(cè)目標(biāo)蛋白.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

1.2 L-Cys修飾的ZnS量子點(diǎn)的制備

ZnS量子點(diǎn)的制備步驟參照文獻(xiàn)[5]，簡(jiǎn)單如下：將6.25 mmol ZnSO4·7H2O，0.5 mmol MnCl2·4H2O以及20 mL去離子水依次加入到50 mL三口瓶中，混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌30 min，將7.5 mmol Na2S·9H2O溶液逐滴加入到三口瓶中，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2～3 h，即可得到錳摻雜的ZnS量子點(diǎn)；然后，將3.75 mmol L-Cys加入到混合物中，常溫避光繼續(xù)攪拌反應(yīng)12 h.合成產(chǎn)物在6 000 r/min下離心8 min后，用水和乙醇反復(fù)洗滌若干次，真空干燥后即可得到L-Cys修飾的ZnS量子點(diǎn).

1.3 量子點(diǎn)-分子印跡聚合物生物傳感器(QD@MIPs)的制備

將100 mg L-Cys修飾的ZnS量子點(diǎn)和10 mg BHb分散于20 mL PB緩沖液中(0.02 mol/L，pH=6.9，下同)，在120 r/min的轉(zhuǎn)速下常溫孵育1 h；另取20 mL PB緩沖液，在其中加入30 mg丙烯酰胺(AAm)、100 mg N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、30 μL甲基丙烯酸(MAA)和25 mg N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)，混勻后加入上述混合液中，并置于搖床中繼續(xù)孵育1 h；將混合物吹氮?dú)?0 min，在機(jī)械攪拌下加入10%過(guò)硫酸銨(APS，質(zhì)量分?jǐn)?shù))溶液100 μL和30%四甲基乙二胺(TEMED，體積分?jǐn)?shù))溶液100 μL，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24 h；最后將產(chǎn)物收集離心，冷凍干燥后即得到量子點(diǎn)-分子印跡聚合物生物傳感器(QD@MIPs).非分子印跡聚合物(QD@NIPs)的制備過(guò)程除不加BHb外，其他均相同.

1.4 表 征

實(shí)驗(yàn)采用高分辨率透射電鏡(JEM2100，日本)對(duì)合成的QDs、QD@MIPs等材料進(jìn)行形貌和微觀結(jié)構(gòu)分析；使用傅里葉紅外光譜儀(BX FT-IR，珀金埃爾默，美國(guó))測(cè)定合成的QDs、L-Cys-QDs、QD@MIPs、QD@NIPs、BHb等材料的紅外光譜譜圖；使用熒光分光光度計(jì)(RF5301，島津，日本)測(cè)定熒光光譜，狹縫寬度為5 nm，最大激發(fā)波長(zhǎng)為318 nm；使用紫外分光光度計(jì)(UV-1800，島津，日本)測(cè)定紫外吸收光譜和吸光度，紫外吸收波長(zhǎng)為280 nm.

1.5 吸附動(dòng)力學(xué)

為了測(cè)定QD@MIPs的吸附平衡時(shí)間，對(duì)其吸附動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究.分別將8 mg的QD@MIPs和QD@NIPs分散于40 mL PB緩沖液中，各加入2 mg BHb，每3 min測(cè)定一次熒光強(qiáng)度.

1.6 選擇性和特異性

本實(shí)驗(yàn)以BSA、Lyz和OVA為參照蛋白，研究QD@MIPs的選擇性.步驟如下：在10 mL離心管中加入1 mL 1 mg/mL QD@MIPs溶液、100 μL 2.5 mg/mL的BHb溶液和3.9 mL的PB緩沖液，15 min后測(cè)定其熒光強(qiáng)度，分別使用BSA、Lyz和OVA代替BHb重復(fù)上述過(guò)程.作為對(duì)照，使用QD@NIPs重復(fù)上述過(guò)程.對(duì)于特異性，同樣選用BSA、Lyz和OVA作為競(jìng)爭(zhēng)蛋白.分別將0，25，50，100，200 μg/mL的競(jìng)爭(zhēng)蛋白加入上述混合液中，并在15 min后測(cè)定混合物的熒光強(qiáng)度.

1.7 溫敏性研究

N-異丙基丙烯酰胺是一種常用的溫敏材料，其在32 ℃左右的水溶液中具有較低的臨界溶解溫度(LCST)，而且可以在熱刺激下控制體積收縮/膨脹，實(shí)現(xiàn)其疏水/親水性質(zhì)的突變等[6].本實(shí)驗(yàn)也考察了制備的QD@MIPs在不同溫度下的吸附和洗脫效率，具體方法如下：設(shè)置QD@MIPs分別在-15，0，20，25，30，35，40，45 ℃溫度梯度下洗脫，洗脫采用10%乙酸-乙腈溶液，洗脫6 h后分別測(cè)定前后熒光變化；設(shè)置質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的洗脫后QD@MIPs分別在0，20，25，30，35，40，45，50，55，60 ℃溫度梯度下吸附，BHb的質(zhì)量濃度為50 μg/mL，分別測(cè)定吸附前后熒光強(qiáng)度變化.

1.8 實(shí)際樣品分析

實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定QD@MIPs在實(shí)際樣品中的應(yīng)用能力，雞蛋清購(gòu)買于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，人尿液樣品隨機(jī)采集于健康志愿者.將樣品稀釋200倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在實(shí)際樣品中分別加入0，30，50，100 μg/mL的BHb溶液、1 mL 1 mg/mL的QD@MIPs溶液和一定量的PB緩沖液，使得QD@MIPs的質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，混合物總體積為5 mL，在15 min后使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定混合物的熒光強(qiáng)度.

2 結(jié)果與討論

2.1 量子點(diǎn)-分子印跡聚合物生物傳感器(QD@MIPs)的制備

量子點(diǎn)-分子印跡聚合物(QD@MIPs)的制備過(guò)程如圖1所示：首先通過(guò)化學(xué)共沉淀法合成了ZnS量子點(diǎn)，其次使用L-半胱氨酸通過(guò)配體交換對(duì)ZnS量子點(diǎn)進(jìn)行了表面修飾，這既降低了量子點(diǎn)的毒性，又提高了量子點(diǎn)的分散性和生物相容性.然后以L-半胱氨酸修飾的ZnS量子點(diǎn)為印跡載體，選用丙烯酰胺(AAm)、甲基丙烯酸(MAA)和N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)為功能單體，N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)為交聯(lián)劑，BHb為模板蛋白，再在引發(fā)劑過(guò)硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)的作用下在量子點(diǎn)表面印跡形成具有“核-殼”結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)-分子印跡聚合物.采用10%乙酸-乙腈溶液在0 ℃下洗脫后，量子點(diǎn)表面印跡聚合物層留下與模板蛋白BHb形狀大小相匹配的印跡空穴.當(dāng)分子印跡量子點(diǎn)材料再次結(jié)合模板蛋白后，由于模板蛋白與量子點(diǎn)之間的電子能量傳遞作用，會(huì)對(duì)量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度造成影響表現(xiàn)出明顯熒光猝滅現(xiàn)象.根據(jù)這一現(xiàn)象，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化可以分析模板蛋白與印跡聚合物的結(jié)合情況，計(jì)算樣品中模板蛋白的濃度.因此，實(shí)驗(yàn)制備的量子點(diǎn)-分子印跡聚合物可作為一種新型生物傳感器應(yīng)用于目標(biāo)蛋白的分析檢測(cè).

這完全出乎張仲平的意料，覺(jué)得初次見(jiàn)面不該開(kāi)那么過(guò)份的玩笑，與此同時(shí)，他倒是增加了對(duì)曾真的好感，畢竟，現(xiàn)在還會(huì)臉紅的女孩子可是不多了。

2.2 表 征

2.2.1透射電鏡(TEM)表征

L-Cys修飾的ZnS量子點(diǎn)與QD@MIPs的TEM透射電鏡結(jié)果如圖2所示.從圖2中可知，制備的L-Cys修飾的ZnS量子點(diǎn)粒徑較小，尺寸均一，直徑大約為4 nm，可以看到明顯的晶格結(jié)構(gòu)；制備的QD@MIPs同樣分散均勻，尺寸略大，約為6～7 nm，這說(shuō)明印跡層的包覆影響了量子點(diǎn)的大小，從中可以推算印跡層的厚度約為1～2 nm，相對(duì)較薄，有利于QD@MIPs材料對(duì)模板蛋白的洗脫和結(jié)合，這也是材料對(duì)模板蛋白熒光響應(yīng)快速的原因.

2.2.2傅里葉紅外光譜(FT-IR)表征

實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)材料進(jìn)行了傅里葉紅外光譜表征，結(jié)果如圖3所示.通過(guò)對(duì)比圖3(a)中BHb和QD@MIPs的紅外光譜譜圖可以發(fā)現(xiàn)，二者在1 420 cm-1左右均有較強(qiáng)的酰胺鍵中C-N鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，而在QD@NIPs的紅外光譜譜圖中并未發(fā)現(xiàn)，這說(shuō)明BHb成功地印跡在QD@MIPs中；對(duì)比圖3(b)中QD和L-Cys-QD的紅外光譜譜圖可以看到位于3 500～3 000 cm-1，1 600～1 550 cm-1和1 400 cm-13處的羧基COO-基團(tuán)的振動(dòng)吸收峰，位于3 420～2 900 cm-1的氨基-NH2基團(tuán)的振動(dòng)吸收峰和800～600 cm-1的C-S鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，而在QDs的譜圖的相應(yīng)位置沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的吸收峰，這說(shuō)明L-Cys成功地修飾在量子點(diǎn)的表面上.

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)

如圖4(a)所示，制備的QD@MIPs生物傳感器的熒光猝滅在15 min內(nèi)隨著QD@MIPs/QD@NIPs對(duì)BHb吸附量的增加而逐漸降低.最后，15 min左右熒光猝滅無(wú)明顯變化，說(shuō)明QD@MIPs/QD@NIPs對(duì)BHb的吸附達(dá)到平衡.

2.4 BHb的檢測(cè)

由于光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，模板蛋白對(duì)QD@MIPs生物傳感器的熒光猝滅遵循Stern-Volmer方程，公式如下

F0/F=KSV[c]+1,

(1)

式中：F0為初始熒光強(qiáng)度；F為加入蛋白質(zhì)后的熒光強(qiáng)度；KSV為熒光猝滅常數(shù)；[c]為蛋白質(zhì)剛加入時(shí)的濃度.根據(jù)上述公式計(jì)算不同蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的KSV值并作圖.

根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)檢出限的規(guī)定，本方法檢出限按照如下公式計(jì)算

DL=KSb/S，

(2)

式中：Sb為空白20次測(cè)得信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差；S為方法的靈敏度(校準(zhǔn)曲線斜率).取K=3時(shí)計(jì)算方法的檢出限.

實(shí)驗(yàn)研究了不同質(zhì)量濃度BHb對(duì)QD@MIPs生物傳感器的熒光強(qiáng)度影響，并計(jì)算熒光猝滅效率，如圖4(b)所示.從圖中可以明顯看出，在BHb較低的0.15～2.30 μmol/L濃度范圍內(nèi)，QD@MIPs熒光猝滅程度對(duì)BHb濃度呈良好的線性關(guān)系，R2為0.986 9.其檢測(cè)方程為

F0/F=0.4367[cBHb]+1，

式中[cBHb]為BHb的濃度(μmol/L).根據(jù)式(2)計(jì)算制備的QD@MIPs對(duì)模板蛋白(BHb)的檢測(cè)限為0.097 μmol/L.因此，該方法可作為一種定量分析BHb的可靠手段.

2.5 溫敏性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了洗脫和吸附前后的熒光強(qiáng)度變化.如圖5(a)所示，在0 ℃的條件下洗脫，洗脫前后的熒光強(qiáng)度變化最大，即在該溫度下洗脫效率最高，這是因?yàn)樵谳^低的溫度下，N-異丙基丙烯酰胺所在的印跡聚合物層的親水性增強(qiáng)，更容易與強(qiáng)極性的洗脫劑形成氫鍵，有利于模板蛋白在聚合物層的釋放；從圖5(b)中明顯看到，隨著溫度的升高，模板蛋白BHb對(duì)QD@MIPs的猝滅效率不斷升高，這是因?yàn)殡S著溫度的升高，N-異丙基丙烯酰胺的存在使印跡聚合物層由親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷?，印跡聚合物層與模板蛋白的疏水作用增強(qiáng)，吸附性能增加，故而模板蛋白對(duì)QD@MIPs的猝滅效果也在升高.在達(dá)到50 ℃時(shí)，繼續(xù)升溫對(duì)猝滅效率沒(méi)有明顯的改變，考慮到過(guò)高的溫度可能會(huì)使BHb變性以及對(duì)量子點(diǎn)的穩(wěn)定性有影響，因此選擇50 ℃作為BHb的最適檢測(cè)溫度.

2.6 選擇性和特異性

采用印跡因子(IF，KSV,MIP/KSV,NIP)來(lái)評(píng)價(jià)QD@MIPs生物傳感器的選擇性.如圖6所示，BHb的KSV, MIP值明顯高于其他參照蛋白，且IF為3.08，說(shuō)明QD@MIPs對(duì)模板蛋白BHb具有較高的選擇性.實(shí)驗(yàn)同樣考察了QD@MIPs生物傳感器的特異性，將不同濃度的BSA、Lyz、OVA分別與BHb混合，研究其特異性識(shí)別能力，如圖6(b)～6(d)所示.從圖中可以看出，改變不同濃度的BSA、Lyz和OVA對(duì)由BHb產(chǎn)生的熒光猝滅沒(méi)有明顯影響，這是因?yàn)橛≯E“孔穴”的識(shí)別位點(diǎn)與其他參照蛋白不匹配，從而導(dǎo)致3種參照蛋白對(duì)QD@MIPs的熒光猝滅機(jī)會(huì)較小.因此，QD@MIPs生物傳感器對(duì)BHb檢測(cè)具有良好的特異性.

2.7 實(shí)際樣品分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了制備的QD@MIPs生物傳感器在雞蛋清和人體尿液樣品中的實(shí)際應(yīng)用能力.由表1可知，QD@MIPs生物傳感器對(duì)蛋清樣品的回收率為99.92%～102.43%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～4.5%，對(duì)人尿液樣品的回收率為100.30%～104.79%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～4.1%.因此，QD@MIPs生物傳感器對(duì)于真實(shí)樣品中BHb含量低的靈敏、準(zhǔn)確測(cè)定具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和可靠性.

將制備的QD@MIPs生物傳感器的檢測(cè)性能與其他工作進(jìn)行對(duì)比，如表2所示.從中可以看出，與其他工作相比，本實(shí)驗(yàn)中制備的QD@MIPs對(duì)目標(biāo)蛋白BHb的響應(yīng)時(shí)間較短，檢測(cè)限較低.另外，本實(shí)驗(yàn)中使用的ZnS量子點(diǎn)具有較低的生物毒性和較好的生物相容性，更適合于生物樣品的檢測(cè)和分析.

表1 QD@MIPs生物傳感器在雞蛋清和人尿液樣品中檢測(cè)BHb的回收率和RSD

Tab.1 Results of spiked recoveries and RSD for detection of BHb in egg albumen and human urine sample using QD@MIPs biosensor

樣品加入量/(μg·mL-1)檢測(cè)量/(μg·mL-1)回收率±RSD/(%,n=3)雞蛋清00-3030.73 102.43±2.35049.9699.92±3.1100100.77100.77±4.5人尿液00-3031.43104.79±3.65050.15100.30±2.5100101.24101.24±4.1

表2 QD@MIPs生物傳感器的分析檢測(cè)性能與其他工作的對(duì)比

3 結(jié) 論

本文以L-半胱氨酸修飾的ZnS量子點(diǎn)為印跡載體，采用表面印跡技術(shù)制備了量子點(diǎn)-分子印跡聚合物生物傳感器(QD@MIPs)，并應(yīng)用于BHb的檢測(cè)分析.結(jié)果表明，制備的QD@MIPs對(duì)目標(biāo)蛋白BHb有快速的響應(yīng)時(shí)間，可在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)吸附平衡.同時(shí)，該生物傳感器具有溫敏性，在不同的溫度條件下表現(xiàn)出不同的洗脫和吸附效率，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度可實(shí)現(xiàn)對(duì)模板蛋白的高效吸附與釋放.除此之外，BHb在0.15～2.30 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，其對(duì)QD@MIPs的猝滅程度與濃度呈良好的線性關(guān)系，R2為0.986 9.與傳統(tǒng)的分子印跡聚合物相比，這種生物傳感器制備過(guò)程簡(jiǎn)單，成本較低，操作簡(jiǎn)便，具有良好的選擇性和特異性識(shí)別檢測(cè)和定量分析目標(biāo)物的能力，并可推廣應(yīng)用到其他生物大分子的識(shí)別檢測(cè)中，在生物分析分離領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用潛力.