應(yīng)用AG490阻斷STAT3對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡Th17/Treg平衡的調(diào)控研究

黃可可 周春燕 顏志婷 葉海燕

【摘要】 目的：研究應(yīng)用免疫抑制劑AG490阻斷信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE） 患者輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）平衡的調(diào)控。方法：選取本院于2018年10月-2019年6月收治的10例SLE（觀察組）以及10例體檢健康者（對(duì)照組），抽取所有受試者外周血約10 mL，采用免疫磁珠法提取CD4+T細(xì)胞，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所有受試者Th17/Treg細(xì)胞亞群變化。用AG490（0、25、50、100 μM）處理患者CD4+T細(xì)胞，檢測(cè)Th17/Treg細(xì)胞亞群以及細(xì)胞因子變化，并采用Q-PCR了解STAT3、Foxp3、RORγt水平。結(jié)果：觀察組患者Th17顯著高于對(duì)照組，而Treg水平顯著低于對(duì)照組，兩組患者Th17/Treg比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著AG490濃度的增加，Th17/Treg比值、IL-6、IL-17表達(dá)水平均逐漸降低，而IL-10、TGF-β水平均顯著增加，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)過不同濃度AG490處理后，STAT3、RORγt mRNA水平以及STAT3蛋白水平均顯著降低，其中100 μM劑量組蛋白水平顯著低于其他三組，而Foxp3 mRNA水平顯著增加，各組mRNA水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：通過阻斷STAT3信號(hào)通路，可誘導(dǎo)Treg分化以及抑制Th17分化，從而調(diào)控Th17/Treg平衡，可為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療提供新方向。

【關(guān)鍵詞】 信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 輔助性T細(xì)胞17 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

[Abstract] Objective： To study the regulation of Th17/Treg balance in systemic lupus erythematosus by blocking STAT3. Method： A total of 10 cases of SLE （observation group） and 10 healthy persons undergoing physical examination （control group） were selected in our hospital from October 2018 to June 2019. All subjects were drawn with peripheral blood of about 10 mL， CD4+ T cells were extracted by immunomagnetic beads method and the changes of Th17/Treg cell subsets were detected by flow cytometry. CD4+ T cells were treated with AG490 （0， 25， 50， 100 μM）， the changes of Th17/Treg cell subsets and cytokines were detected and the levels of STAT3， Foxp3， RORγt were detected by Q-PCR. Result： The level of Th17 in the observation group was significantly higher than that in the control group， but the level of Treg was significantly lower than that in the control group， there was significant difference in Th17/Treg between the two groups （P<0.05）. With the increase of AG490 concentration， the expression level of Th17/Treg ratio and IL-6， IL-17 decreased gradually， while the level of IL-10， TGF-β increased significantly， with significant difference among the groups （P<0.05）. After AG490 treatment， the levels of STAT3， RORγt mRNA and STAT3 protein were significantly decreased， the levels of 100 μM dose group were significantly lower than those of the other three groups， while the level of Foxp3 mRNA was significantly increased， and the level of mRNA in each group was significantly different （P<0.05）. Conclusion： Blocking STAT3 signaling pathway can induce Treg differentiation and inhibit Th17 differentiation， thus regulating Th17/Treg balance， which can provide a new direction for the treatment of systemic lupus erythematosus.

[Key words] Signal transduction and activator of transcription 3 Systemic lupus erythematosus Helper T cells Regulatory T cells

First-authors address： Pingxiang Peoples Hospital， Pingxiang 337000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.34.036

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病，其發(fā)病可能涉及環(huán)境因素、遺傳因素、藥物以及激素等多個(gè)方面[1]。盡管目前對(duì)于其的具體機(jī)制尚未明確，但越來越多研究表明T細(xì)胞功能過度活化在SLE發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[2-3]。AG490（α-氰基-（3，4-羥基）N-芐苯乙烯胺）是JAK2（Janus蛋白酪氨酸激酶）的特異性拮抗劑，JAK2/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是Th細(xì)胞極化和增殖的重要通路，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）是Th17細(xì)胞分化、增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心，可調(diào)控輔助性T細(xì)胞17（T helper 17 cells， Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulator T cells，Treg）的平衡[4]。研究表明SLE的發(fā)生發(fā)展與Th17/Treg平衡失調(diào)，其中Th17可分泌IL-17，從而加強(qiáng)TNF-α的致炎作用，而Treg通過分泌負(fù)性調(diào)節(jié)因子（TGF-β、IL-10）發(fā)揮免疫抑制作用，從而降低機(jī)體炎癥反應(yīng)[5]。王慧蓮等[6]研究發(fā)現(xiàn)通過升高Treg、降低Th17細(xì)胞的比例可發(fā)揮SLE治療效果。目前針對(duì)細(xì)胞免疫異常的免疫干預(yù)治療逐漸成為SLE研究熱點(diǎn)，本課題組結(jié)合免疫學(xué)領(lǐng)域最新研究成果，提出應(yīng)用AG490阻斷STAT3后對(duì)SLE Th17/Treg平衡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院于2018年10月-2019年6月收治的10例SLE患者（觀察組）以及10例體檢健康者（對(duì)照組），年齡18～60歲，男8例，女12例。該研究已獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)頒布的關(guān)于SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];年齡≥18歲，生命體征良好;對(duì)照組受試者均為同期于本院體檢合格者，且隨機(jī)選擇，病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并自身免疫性疾病、活動(dòng)期的結(jié)核性疾病、嚴(yán)重感染者（危及生命）;嚴(yán)重心肺功能不全者，凝血功能障礙，精神疾病者;入組前半年使用免疫抑制劑。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集 受試者入組后于清晨空腹抽取外周肘靜脈血約10 mL，置于肝素鈉抗凝管中，根據(jù)試劑盒操作步驟，采用免疫磁珠法分離，獲取受試者外周血中的CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞純度超過90%，并于CD4+T細(xì)胞中加入AIM-V Medium CTS培養(yǎng)基，置于飽和濕度培養(yǎng)箱（37 ℃×5% CO2）中培養(yǎng)，便可進(jìn)行以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.2 Th17與Treg細(xì)胞水平 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組受試者Th17、Treg水平，具體操作如下：分離得到CD4+T細(xì)胞后，加入表面染色FITC-IL-10或者FITC-IL-17，細(xì)胞經(jīng)過固定、破膜后，加入PE-RORγt進(jìn)行染色，于4 ℃溫孵育30 min，用PBS洗滌3次后并懸浮于PBS中，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)即可。

1.2.3 AG490處理 觀察組10例患者CD4+T細(xì)胞等體積混勻后平行取4×5份混合細(xì)胞，分別加入不同濃度的AG490（0、25、50、100 μM），即每個(gè)濃度平行5次，于飽和濕度培養(yǎng)箱（37 ℃×5% CO2）中培養(yǎng)72 h后可依次檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞因子水平以及STAT3 mRNA水平。

1.2.4 細(xì)胞因子水平 觀察組10例患者CD4+T細(xì)胞等體積混勻后平行取4×5份混合細(xì)胞，分別加入不同濃度的AG490（0、25、50、100 μM），即每個(gè)濃度平行5次，取出經(jīng)不同濃度處理后的CD4+T細(xì)胞，按照ELISA試劑合說明書操作檢測(cè)IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β的水平，采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量每孔OD值，λ為450 nm，平行5份。

1.2.5 相關(guān)mRNA水平 觀察組10例患者CD4+T細(xì)胞等體積混勻后平行取4×5份混合細(xì)胞，分別加入不同濃度的AG490（0、25、50、100 μM），即每個(gè)濃度平行5次，取出經(jīng)不同濃度處理后的CD4+T細(xì)胞，采用Trizol提取細(xì)胞總RNA，取出2 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參基因，按照mRNA檢測(cè)試劑盒提示建立PCR反應(yīng)體系，具體條件：50 ℃、2 min;95 ℃、15 min;60 ℃、30 s;72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)，用2-ΔΔCt計(jì)算表示表達(dá)水平。見表1。

1.2.6 STAT3蛋白水平 采用Western blot測(cè)定STAT3蛋白水平。收集不同濃度處理后的CD4+T細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將待測(cè)蛋白液上樣到十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（10%）凝膠電泳中，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，隨即轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉（5%）封閉1 h，將膜取出，清洗，分別加入稀釋度為1︰1 000β-Actin、1︰1 000 STAT3的一抗孵育，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，使用二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記物（濃度1︰2 000） 37 ℃孵育2 h，TBST洗滌3次，最后滴加ECL進(jìn)行曝光顯影，檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶，分析各條帶灰度值，STAT3與β-Actin條帶灰度值之比為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較 兩組受試者基本資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.2 兩組Th17與Treg細(xì)胞水平比較 觀察組患者Th17顯著高于對(duì)照組，而Treg水平顯著低于對(duì)照組，兩組患者Th17/Treg差異顯著，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3 不同濃度AG490對(duì)兩組Th17/Treg細(xì)胞平衡的影響 給予不同濃度的AG490后Th17/Treg比值均顯著低于空白觀察組（未加AG490）的（1.45±0.48），AG490濃度分別為25、50、100 μM時(shí)，Th17/Treg比值分別為（1.07±0.32）、（0.78±0.21）、（0.62±0.14），各組Th17/Treg水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.298，P=0.000）。

2.4 不同濃度AG490對(duì)Th17與Treg細(xì)胞因子水平的影響 隨著AG490濃度的增加IL-6、IL-17表達(dá)水平均顯著降低，而IL-10、TGF-β水平均顯著增加（P<0.05），見表4。

2.5 不同濃度AG490對(duì)相關(guān)mRNA水平的影響 經(jīng)過不同濃度AG490處理后，STAT3、RORγt mRNA水平均顯著降低，F(xiàn)oxp3 mRNA水平顯著增加，其中加入不同濃度（0、25、50、100 μM）的AG490后，各組mRNA水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表5。

2.6 不同濃度AG490對(duì)STAT3蛋白水平的影響 經(jīng)過不同濃度AG490處理后，STAT3蛋白水平顯著低于未給予AG490組的（0.95±0.25），AG490濃度分別為25、50、100 μM時(shí)，STAT3蛋白水平分別為（0.75±0.18）、（0.57±0.09）、（0.45±0.06），各組STAT3蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.931，P=0.000）。見圖1。

3 討論

SLE是臨床常見的免疫系統(tǒng)疾病，多發(fā)于女性，可累及中樞神經(jīng)、皮膚黏膜、骨骼肌肉、腎等[8]。

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，可在特定環(huán)境中分化為Th1、Th2、Th17、Treg等細(xì)胞，共同調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)，其中Th17與Treg的分化發(fā)育相互制約，Treg細(xì)胞可分泌TGF-β和IL-10，從而抑制巨噬、淋巴細(xì)胞的免疫功能，維持機(jī)體免疫耐受，而Th17則分泌IL-17、IL-6，從而調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞向組織局部浸潤(rùn)，引起系統(tǒng)損傷[9-10]。Th17/Treg平衡失調(diào)，則可反映SLE進(jìn)展。此次研究結(jié)果顯示，觀察組患者Th17、Th17/Treg均顯著高于對(duì)照組，而Treg水平均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），與胡偉等[11]報(bào)道一致，Th17/Treg的免疫平衡參與SLE的病理生理進(jìn)程，其中Th17水平的增加可加劇機(jī)體炎性反應(yīng)，促進(jìn)SLE發(fā)展。

目前SLE的治療通常采用以糖皮質(zhì)激素為基礎(chǔ)的免疫抑制劑聯(lián)合療法，但抑制不足導(dǎo)致病情遷延反復(fù)，盡管西羅莫司、霉酚酸酯等新型免疫抑制劑不斷涌現(xiàn)，但是療效欠佳，因此深入了解SLE的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要[12-13]。STAT3可通過調(diào)控JAK/STAT通路而參與細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)等過程，可與轉(zhuǎn)錄因子RORγt結(jié)合，調(diào)控Th17細(xì)胞分化增殖，還能與Treg細(xì)胞Foxp3基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上特定部位結(jié)合抑制Foxp3的表達(dá)，誘導(dǎo)Treg向Th17轉(zhuǎn)化，引起系膜細(xì)胞增殖、皮膚病變、瘙癢等[14-15]。陳曦等[16]報(bào)道顯示阻斷該信號(hào)通路可調(diào)控T細(xì)胞趨化活性，但具體作用機(jī)制并未明確。本次選用AG490作為JAK/STAT信號(hào)通路特異性阻斷劑，通過給予不同濃度（0、25、50、100 μM）的AG490后，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加Th17/Treg比值逐漸降低，表明AG490抑制JAK/STAT信號(hào)通路后，Th17分化程度逐漸降低，而Treg分化程度逐漸增加，故而經(jīng)過AG490處理后IL-6、IL-17表達(dá)水平均顯著降低，而IL-10、TGF-β水平均顯著增加（P<0.05）。其中Th17分泌的IL-17可加強(qiáng)TNF-α的致炎作用，以及促進(jìn)機(jī)體中心粒細(xì)胞的增殖、分化以及趨化，從而發(fā)揮強(qiáng)大的促炎性作用，而IL6可誘導(dǎo)STAT3的活化，促進(jìn)STAT3作用于IL-17啟動(dòng)區(qū)，誘導(dǎo)IL-17的分泌，兩者相互作用，共同加快了Th17的分化，加重疾病進(jìn)展[6，17]。IL-10、TGF-β是由Treg分泌的一類抑制性的細(xì)胞因子，通過加入AG490后使得Treg分化程度增加，故而IL-10、TGF-β表達(dá)水平顯著增加。

RORγt、Foxp3分別為Th17、Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子[18]，通過AG490處理后，Th17/Treg平衡向Treg失衡，故而RORγt mRNA表達(dá)水平顯著降低，而Foxp3 mRNA水平顯著增加，與王慧蓮等[6]報(bào)道一致，即通過升高Treg以及降低Th17細(xì)胞的比例，可有效調(diào)控RORγt、Foxp3的水平，可為SLE治療提供新的切入點(diǎn)。Foxp3、RORγt相互拮抗，經(jīng)過AG490處理后，STAT3表達(dá)降低，F(xiàn)oxp3會(huì)優(yōu)先表達(dá)，促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化，一旦抑制解除，STAT3則高表達(dá)，STAT3則會(huì)抑制Foxp3的表達(dá)，從而促進(jìn)Treg向Th17轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)IL-17的分泌[19]。故而應(yīng)用AG490阻斷STAT3信號(hào)通路后，可抑制Th17的分化，從而使得Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)水平降低，可緩解緩、炎性反應(yīng)，解除STAT3對(duì)Foxp3的抑制，有利于Treg分化，Treg分化相關(guān)因子表達(dá)的增加，使得使Th17/Treg平衡向Treg傾斜，從而穩(wěn)定機(jī)體免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)免疫耐受，發(fā)揮SLE的治療效果。

綜上所述，通過阻斷STAT3信號(hào)通路，可誘導(dǎo)Treg分化以及抑制Th17分化，從而調(diào)控Th17/Treg平衡，可為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療提供新方向。

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（收稿日期：2019-08-26） （本文編輯：周亞杰）