微透析法研究六味地黃丸在腎陰虛糖尿病大鼠模型的藥動學

王華富，桂志紅，張小如，葉一萍，丁 汀，儲衛(wèi)華

(1.麗水市人民醫(yī)院臨床藥學科，麗水 323000;2.麗水市人民醫(yī)院腎內科，麗水 323000;3.麗水市人民醫(yī)院中醫(yī)科，麗水 323000；4.中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 210009)

腎陰虛型糖尿病的癥狀主要為尿頻量多、混濁如脂膏、尿甜、口干、頭暈和腰腿酸痛[1]。六味地黃丸作為治療腎陰虛型糖尿病的主要藥物，其使用劑量依醫(yī)生經驗給出。本次實驗利用微透析取樣法，采集腎陰虛型糖尿病大鼠模型的透析液，并處理大鼠的糖尿病效應細胞[2]，檢測效應細胞的變化情況，進而得到六味地黃丸對腎陰虛型糖尿病效應細胞的 “藥物劑量/D-時間/t-效應/E”模型，得出具有臨床意義的六味地黃丸給藥方案。

1 儀器與材料

1.1儀器 微透析系統(tǒng)，包括CMA402微透析泵、CMA12Elite PAES微透析探針(膜長1 mm)和CMA/170微透析樣品收集器3部分，均為瑞典CMA公司生產；XR 205SM DR分析天平(瑞士Precisa公司)。

1.2材料 藥物：六味地黃丸(濃縮丸，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)。

腎陰虛型糖尿病模型大鼠[3]：選擇大鼠高脂蔗糖飲食聯(lián)合熱應激處理造模方法，成年雌性Wistar大鼠，給予主要含質量分數(shù)為20%的豬油和50%的蔗糖為食料，造模時每天被置于干燥球室40球、濕球32球的人工氣候室內進行熱應激3 h處理。

試劑：質量濃度為20 g·L-1的戊巴比妥鈉溶液(購自Sigma Aldrich公司，批號69020100)。D-Hanks液(批號14170-112)，Hanks液(批號14025-076)，Kreb-hepes緩沖液(批號15630080)，PBS緩沖液(批號20012-043)，均購自賽默飛世爾公司。質量濃度為4 g·L-1的臺盼藍(Solarbio公司，批號T8070)，1%膠原酶Ⅱ型(YEASEN公司，批號40508ES60)，體積分數(shù)為10%的胎牛血清(Science Cell公司，批號0500)。100 u·mL-1青霉素(批號Z130437)和質量濃度為100 μg·mL-1的鏈霉素(批號S66602)，上海源葉生物科技公司。質量濃度為0.167 mg·mL-1的LiberaseRI酶溶液(羅氏生物公司，批號11213865001)，F(xiàn)icoll溶液(南京森貝伽生物科技有限公司，批號SBJ-0155)，5%肝素鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號9041-08-1)。丹皮酚(批號552-41-0)，馬錢苷(批號18524-94-2)，莫諾苷(批號25406-64-8)，芍藥苷(批號23180-57-6)，均購自成都德思特生物技術有限公司。林格氏液(NaCl 8.5 g，KCl 0.3 g，CaCl20.33 g，ddH2O 1 L)。

2 方法

2.1糖尿病效應細胞的分離和培養(yǎng) 模型大鼠肝細胞的分離純化和培養(yǎng)[4-5]：成年雌性Wistar大鼠，腹腔注射質量濃度為20 g·L-1的戊巴比妥鈉溶液麻醉(30 mg·kg-1)，200 u肝素鈉溶液。皮膚消毒后，腹部切開U形切口，暴露門靜脈，導管從門靜脈插入2 cm。導管連接到一次性輸血器。后端被連接到輸液瓶，注射用無鈣和鎂的Hanks液(EDTA 1 mmol·L-1的溶液)200 mL，從下腔靜脈導管注射Hanks液(含有質量濃度為0.5 g·L-1的Ⅱ型膠原酶)100 mL,靜滴速率為15 mL·min-1。取出肝臟，置于含Hanks液的平板上，在4 ℃清除肝包膜和血管肝靜脈閉塞，鈍性撕肝組織，并透過多層紗布制成細胞懸液。濾過200目不銹鋼篩網(wǎng)，以42 g·min-1離心2 min，棄上清液用Hanks溶液，4 ℃離心3次，除去非肝細胞。通過質量濃度為4 g·L-1的臺盼藍染色測定細胞活性。分離鈍化的肝細胞合成培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM)在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，在倒置相差顯微鏡下觀察6 h后的生長情況。

模型大鼠脂肪細胞的分離純化和培養(yǎng)[6]：分離大鼠脂肪組織，立即放在Kreb-HEPES緩沖液(KRHB)中，轉移到低溫實驗室。在超凈臺中分離并去除脂肪組織中的白色筋膜和血管，KRHB溶液洗滌3次。切碎脂肪組織，放在含體積分數(shù)5%胎牛血清白蛋白的質量濃度為10 g·L-1Ⅱ型膠原酶中消化，37 ℃搖床振蕩1 h，100目過濾網(wǎng)篩細胞，濾液以1 000 r·min-1離心5 min，收集，脂肪細胞浮在最上面，再加上含有100 u·mL-1青霉素、質量濃度為100 mg·mL-1的鏈霉素和體積分數(shù)為10%的胎牛血清的完全培養(yǎng)基，6孔板培養(yǎng)后計數(shù)。

模型大鼠胰島β細胞的分離純化和培養(yǎng)[7-8]：成年雌性Wistar大鼠斷脊椎處死，膽總管結扎至十二指腸。破碎心臟放血，立即用質量濃度為0.167 mg·mL-1的LiberaseRI酶溶液通過原位快速原位灌注胰腺膽總管，鈍性解剖分離。把胰腺置于50 mL離心管中，37 ℃水浴，同時加入適量消化液靜止消化30 min。消化結束后用Votex振蕩儀劇烈振蕩消化管10 s，終止消化時加入等量PBS緩沖液保存于4 ℃的PBS緩沖液中。分別用直徑1.0和0.5 mm的不銹鋼濾網(wǎng)過濾消化物，離心，得到糜狀消化終產物；把4 mL質量濃度為0.25 g·L-1的Ficoll溶液加入到消化終產物中，渦旋混勻，從下往上逐層加入質量濃度為0.11，0.21和0.23 g·L-1的Ficoll溶液各2 mL，形成界面清晰的密度梯度離心溶液。用水平轉頭進行離心分離，自然加速，零阻力降速，在21%和11%界面分層處吸出細胞團，該細胞團即為純化的胰島β細胞，雙硫腙特異染色法鑒定胰島β細胞純度。

2.2微透析取樣技術的建立 將陰虛糖尿病模型大鼠仰位固定，頸部剪毛備皮，消毒后在大鼠頸部右側沿頸靜脈方向剪2～3 cm的切口，鈍性分離頸靜脈，結扎遠心端，并剪一小口，將浸泡在質量濃度為50 g·L-1的肝素鈉注射液中20 min以上的血液探針朝右心室方向植入約2.5 cm，并用縫合線固定探針。探針植入24 h后，用含不同質量濃度丹皮酚、馬錢苷、莫諾苷和芍藥苷的林格氏液以1.5 μL·min-1的流速灌注探針，平衡1 h后，開始采樣，20 min為取樣間隔，每份樣品20 μL，及時采用HPLC法直接進樣測定，共3次，計算探針的相對回收率，評價微透析系統(tǒng)的實用性和穩(wěn)定性。測定探針的相對回收率后，以2 μL·min-1灌注速度灌注PBS緩沖液，洗脫1 h，開始給藥[9]。

2.3效應細胞的篩選 針對單一細胞，將40只腎陰虛型糖尿病模型大鼠均分為2組，每組20只，實驗組喂服六味地黃丸5倍等效劑量，對照組喂服等量生理鹽水，處理24 h，然后用微透析法采集透析液，并用該液處理提取的細胞，2 h后檢測葡萄糖濃度，從而檢測糖尿病模型大鼠制備的肝細胞、脂肪細胞及胰島β細胞對5倍六味地黃丸臨床等效劑量多次給藥所得微透析液的敏感程度。檢測肝細胞和脂肪細胞對糖代謝的影響[10]，檢測胰島β細胞功能的變化[11]。選取藥物反應變化幅度最大的細胞作為糖尿病敏感效應細胞。

2.4給藥模型的建立和驗證 各實驗組用20只腎陰虛型糖尿病模型大鼠，選擇6,8和12 h 3個給藥時間間隔，各給藥間隔設置4個劑量組，分別為0.5,1,1.5和2倍等效劑量，1倍等效劑量為每次0.1 mg，喂藥前和喂藥48 h后分別收集微透析液，用上一步驟選定的胰島β細胞消化透析液，處理2 h后檢測葡萄糖濃度，分析濃度變化并給出最優(yōu)給藥方案。

2.5最優(yōu)給藥方案與常規(guī)方案比較 實驗組使用20只腎陰虛型糖尿病模型大鼠，以2.4項下步驟確定的最優(yōu)方案給藥，分別收集給藥后4，8，12，16，24，36，48和72 h的微透析液，處理胰島β細胞2 h后檢測葡萄糖濃度；對照組采用常規(guī)給藥方案，即間隔8 h、1倍等效劑量，同樣收集上述幾個時間點的微透析液并處理效應細胞，檢測葡萄糖濃度。比較檢測結果，分析優(yōu)化后的給藥方案是否比常規(guī)方案有優(yōu)勢。

3 結果

3.1糖尿病效應細胞的篩選 六味地黃丸多次給藥所得微透析液中既含有血糖又含有藥物成分，故可作為參考指標考量細胞的糖代謝能力，用提取的3種細胞消化微透析液(服藥24 h后)，2 h后檢測葡萄糖濃度。結果表明，3種細胞處理的含藥微透析液葡萄糖濃度均比服用生理鹽水顯著下降(P<0.01)，但胰島β細胞相較于肝細胞和脂肪細胞更顯著，結果見表1，故選擇胰島β細胞為六味地黃丸微透析液的效應細胞。

表13種細胞對微透析液敏感程度的差異

Tab.1 Differences in sensitivity of 3 type cells to microdialysate (n=20)

細胞葡萄糖濃度/mmol·L-1處理前處理后tP肝細胞10.497±0.39111.508±0.6336.077<0.01脂肪細胞10.624±0.57011.447±0.3275.601<0.01胰島β細胞10.153±0.41211.601±0.44510.678<0.01

3.2“藥物劑量/D-時間/t-效應/E”模型的建立 給藥間隔選擇6，8和12 h 3個時間點；給藥劑量為等效劑量，0.5即為0.5倍等效劑量，1倍等效劑量為0.1 mg；給藥前和給藥后48 h收集透析液。各處理組處理后的葡萄糖濃度均顯著低于處理前(P<0.01)，可以證明六味地黃丸對腎陰虛型糖尿病有較好的療效，其中給藥間隔12 h，每次1.5倍等效劑量的處理組處理后葡萄糖濃度顯著低于其他組(P<0.05)。故給藥間隔12 h，每次給藥1.5倍等效劑量，即0.15 mg療效最佳，此給藥方案為最優(yōu)方案。見表2。

3.3最優(yōu)給藥方案與常規(guī)給藥方案對比 結果顯示，最優(yōu)給藥方案下，葡萄糖濃度36 h即到達穩(wěn)定值，且下降幅度更大(P<0.05)，而常規(guī)方案需要48 h到達穩(wěn)定，因此整體治療效果優(yōu)于常規(guī)給藥方案。見表3。

表2給藥間隔-劑量-療效相關性

Tab.2 Dosage interval-dose-efficacy correlation (n=20)

給藥間隔/h等效劑量/倍葡萄糖濃度/mmol·L-1處理前處理后tP60.511.432±0.3179.611±0.42615.337<0.011.011.497±0.4359.576±0.38114.857<0.011.511.393±0.6019.602±0.44910.676<0.012.011.488±0.4949.645±0.51211.585<0.0180.511.504±0.4719.634±0.47912.449<0.011.011.521±0.6179.412±0.39912.836<0.011.511.379±0.5469.509±0.55410.751<0.012.011.408±0.6359.487±0.37111.681<0.01120.511.537±0.5709.781±0.44510.860<0.011.011.477±0.6639.513±0.39111.411<0.011.511.399±0.4479.334±0.57512.680<0.012.011.534±0.4989.435±0.43913.139<0.01

表3最優(yōu)給藥方案與常規(guī)給藥方案對比

Tab.3 Comparison between optimal dosing regimen and conventional dosing regimen (n=20)

給藥后時間/h葡萄糖濃度/mmol·L-1最優(yōu)給藥方案常規(guī)給藥方案tP411.529±0.45211.506±0.4740.1570.876811.243±0.37911.237±0.5010.0430.9661210.862±0.49010.910±0.4350.3280.745169.947±0.53410.271±0.3342.3010.027249.554±0.3989.701±0.4621.0780.288369.391±0.4199.549±0.4181.1940.240489.342±0.5139.422±0.5570.4720.639729.397±0.4669.419±0.3480.1690.867

4 討論

糖尿病在中醫(yī)概念上屬“消渴”。消渴病變分為上、中、下消3種，其中下消(腎虛精虧，即腎陰虛型)為最主要的發(fā)病方式。六味地黃丸重用熟地黃，滋陰補腎，填精益髓，為君藥。山茱萸補養(yǎng)肝腎，并能澀精；山藥補益脾陰，亦能固精，共為臣藥。三藥相配，滋養(yǎng)肝脾腎，稱為“三補”，在臨床上取得了較好的治療效果[12]。微透析取樣法可以做到活體、實時取樣分析，在研究藥物動力學、生物代謝等領域有極大的應用價值[13]。此最優(yōu)方案相對于其他給藥方案在同等治療時間內可以最有效地降低葡萄糖水平，具有臨床推廣的意義。本實驗的不足之處在于處理和檢測步驟均在體外，不能完全模擬體內的復雜環(huán)境。此外，微透析法需要固定模型大鼠，因此可能導致實驗大鼠的生理活性與自由活動的大鼠有差異。

六味地黃丸雖然對腎陰虛型糖尿病有較好的治療效果，但并不適合作為唯一方藥，應輔以其他藥物共同治療。