金梅清暑顆粒的定性定量方法研究

徐向平，胡展晴，葉惠煊，劉淑妦，張振賢，黃 勝*

(1.九芝堂股份有限公司，長沙 410021；2.中南大學湘雅藥學院，長沙 410013)

金梅清暑顆粒現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第十四冊，是九芝堂股份有限公司的獨家生產(chǎn)品種，標準編號為WS3-B-2725-97-2014Z。其處方由金銀花、烏梅、淡竹葉和甘草4味中藥組成，具有清暑解毒和生津止渴的功效，臨床上常用于治療夏季暑熱、口渴多汗、頭昏心煩和小便短赤，并防治沙痱和暑癥[1-2]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695-2998高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；DZKW型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；KQ-300DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AY220型電子分析天平(日本島津公司)；CP225D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；Merck硅膠G薄層層析板(德國默克公司)。

1.2試藥 山銀花對照藥材(批號121595-201202)，灰氈毛忍冬皂苷乙(批號111814-201303)和綠原酸(批號110753-201415)，均為中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)；金梅清暑顆粒(九芝堂股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：15 g·袋-1)；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。本實驗樣品所涉及的藥材均由九芝堂股份有限公司質量中心按照《中國藥典》2015年版一部相應品種項下的質量標準檢驗合格后使用。

2 方法與結果

2.1山銀花TLC鑒別

2.1.1色譜條件 采用硅膠G薄層板，以三氯甲烷-甲醇-水(6∶4∶1)10 ℃下放置的混合溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以質量分數(shù)為10%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點顯色清晰。

2.1.2對照品溶液的制備 取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品適量，加體積分數(shù)為50%的甲醇使溶解，搖勻，制成質量濃度為0.6 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3對照藥材溶液的制備 精密稱取山銀花對照藥材1 g，加入40 mL乙醚使溶解，超聲處理15 min，濾過，濾渣揮干殘留的乙醚后，加甲醇30 mL繼續(xù)超聲處理20 min，濾過，水浴蒸干濾液，殘渣加純化水40 mL使溶解，再用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，加純化水洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液回收溶劑至近干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為對照藥材溶液[3]。

2.1.4供試品溶液的制備 稱取金梅清暑顆粒10 g，研細，按照2.1.3項下方法制成供試品溶液。

2.1.5陰性對照溶液的制備 取處方中除去山銀花的全部藥味，按照處方比例制成缺山銀花的陰性對照樣品。稱取陰性對照樣品10 g，研細，按照2.1.3項下方法制成陰性對照溶液。

2.1.6實驗結果 取連續(xù)生產(chǎn)的3批樣品(批號：20160301，20160302和20160303)，按照2.1.4項下方法分別制成相應的供試品溶液。按照TLC法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)實驗，吸取對照品溶液和對照藥材溶液各5 μL、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按照2.1.1項下色譜條件進行TLC法實驗，結果顯示，在供試品色譜中，與對照藥材和對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性對照色譜中則未見明顯干擾，表明該方法專屬性良好，見圖1。

圖1TLC鑒別

1.灰氈毛忍冬皂苷乙對照品；2.山銀花對照藥材；3.陰性對照；4～6.金梅清暑顆粒樣品。

Fig.1 TLC chromatogram

1.macranthoidin B reference substance；2.LoniceraeFlos reference material；3.negative sample;4-6.Jinmeiqingshu Granules sample.

2.2綠原酸HPLC含量測定

2.2.1色譜條件 采用Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-4 mL·L-1磷酸溶液為流動相，等度洗脫，洗脫體積比為8∶92；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為327 nm；進樣量為5 μL。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇溶解，制成質量濃度為0.283 0 mg·mL-1的對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液5～50 mL，置于棕色量瓶中，加甲醇稀釋定容并搖勻，制成質量濃度為0.028 30 mg·mL-1的對照品溶液，備用。

2.2.3供試品溶液的制備 取樣品粉末0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分數(shù)為30%的甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理(功率300 W，頻率25 kHz)30 min后冷卻至室溫，再加甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。

2.2.4陰性對照溶液的制備 取處方中的全部藥味，按照處方比例制成缺山銀花和烏梅2味藥材的陰性對照樣品，按照2.2.3項下制備方法制得陰性對照溶液。

2.2.5線性關系考察 分別精密吸取對照品溶液2，5，5，1和1 mL，分別置于5，50，100，25和50 mL的棕色量瓶中，加甲醇稀釋定容并搖勻，分別進樣5 μL，測定，以進樣質量濃度為橫坐標(x)、綠原酸的峰面積為縱坐標(y)，進行線性回歸，并繪制標準曲線。其回歸方程為：y=107x-930.94，r=1.000。結果表明，綠原酸含量在28.3～566.0 μg范圍內(nèi)線性關系良好。按照信噪比(S/N)的3和10倍考察檢測限(n=2)和定量限(n=6)，結果檢測限和定量限分別為4.245和11.320 ng。

2.2.6專屬性實驗 取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按照2.2.1項下色譜條件進樣，HPLC圖見圖2。結果顯示，陰性對照溶液的HPLC圖中，在綠原酸色譜峰保留時間附近無其他色譜峰干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2HPLC圖

A.對照品；B.金梅清暑顆粒樣品；C.陰性樣品;1.綠原酸。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.Jinmeiqingshu Granules sample；C.negative sample;1.chlorogenic acid.

2.2.7精密度實驗 精密吸取2.2.3項下制備的供試品溶液5 μL，連續(xù)進樣6次，計算得供試品中綠原酸峰面積的RSD值為1.51%(n=6)，結果表明，該儀器精密度良好。

2.2.8穩(wěn)定性實驗 取同一室溫下放置的供試品溶液，精密吸取5 μL，分別在0，2，4，6，8，12和24 h后進樣，計算其RSD值。結果，綠原酸峰面積的RSD值為1.91%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9重復性實驗 取同一批樣品(批號20160302)，按照2.2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，測定，結果綠原酸峰面積的RSD值為1.80%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.2.10加樣回收實驗 取樣品(批號20160302，綠原酸含量為 1.58 mg·g-1)0.125 g，共6份，精密稱定，分別加入對照品溶液(含綠原酸0.198 1 mg)，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液，進樣測定并計算，結果綠原酸的平均回收率為104.56%，RSD值為2.53%。見表1。

表1綠原酸加樣回收實驗結果

Tab.1 Results of recovery test of chlorogenic acid (n=6)

樣品取樣量/g樣品中綠原酸含量/mg添加綠原酸量/mg實測綠原酸量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.123 70.195 40.198 10.404 0105.30104.562.5320.122 80.194 00.198 10.401 4104.6930.122 10.192 90.198 10.400 0104.5440.116 20.183 60.198 10.399 6109.0450.127 00.200 70.198 10.402 2101.7260.124 80.197 20.198 10.399 4102.07

2.2.11耐用性實驗 選擇2種不同品牌的色譜柱，對已建立的方法耐用程度進行考察。結果顯示，不同條件下，綠原酸色譜峰的對稱因子、分離度和理論塔板數(shù)均達到準確定量要求，表明該方法耐用性良好。見表2。

表2耐用性實驗結果

Tab.2 Results of robustness test (n=2)

色譜柱不同批號的綠原酸含量/mg·g-1201603012016030220160303Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm,5 μm)3.621.613.21Kromasil 100-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)3.661.672.98RSD/%0.551.833.72

2.2.12含量測定 按照2.2.3項下方法平行制備供試品溶液2份，按照2.2.1項下色譜條件分別進樣測定，采用外標一點法計算金梅清暑顆粒中綠原酸的含量，結果10批金梅清暑顆粒樣品中綠原酸的含量分別為3.66，1.67，2.98，1.78，1.86，2.54，2.52，3.63，3.82和4.00 mg·g-1，平均值為2.85 mg·g-1?？紤]到綠原酸化學性質不穩(wěn)定，受熱易分解[4-6]，且該制劑的整個工藝過程較為復雜，會導致綠原酸進一步分解，故按照成品含量平均值的70%折算為1.995 mg·g-1。因此，暫擬定本品山銀花和烏梅以綠原酸(C16H18O9)計含量不得少于2.0 mg·g-1。

3 討論

3.1TLC專屬性考察 近年來，市場上金銀花和山銀花藥材混用的現(xiàn)象較為嚴重[7-8]，使用金銀花或山銀花藥材作為原料的中藥制劑更是難以辨別[9-10]。如不能將二者準確區(qū)分開，易對患者的用藥安全埋下隱患。筆者通過前期文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，二者雖然為同屬植物，但化學成分有較大區(qū)別[11-16]。其中，灰氈毛忍冬皂苷乙是山銀花的特征性成分[17-20]，而金銀花中不含有此成分，故可將灰氈毛忍冬皂苷乙是否檢出作為區(qū)分本制劑中為金銀花還是山銀花投料生產(chǎn)的有效鑒別手段。本實驗建立的TLC鑒別方法特征斑點明顯，分離效果好，能夠作為該制劑中山銀花的專屬性鑒別。

3.2TLC溫度考察 TLC實驗中使用了三氯甲烷-甲醇-水(6∶4∶1)為展開劑，發(fā)現(xiàn)在室溫條件下重復性較差，樣品圖譜易拖尾，影響結果判定。而將樣品放置在10 ℃以下保存的展開劑中展開，則重復性良好，故采用其作為展開條件。

3.3HPLC流動相的選擇 HPLC實驗中比較了3種不同的流動相系統(tǒng)，分別是乙腈-4 mL·L-1磷酸、甲醇-4 mL·L-1磷酸和甲醇-水-冰醋酸。結果表明，在乙腈-4 mL·L-1磷酸流動相系統(tǒng)下，綠原酸色譜峰的保留時間適宜，分離度良好。

3.4HPLC前處理條件優(yōu)化 在建立HPLC法測定山銀花和烏梅中綠原酸含量的方法中，筆者進行了以下單因素系統(tǒng)考察實驗：體積分數(shù)為30%的甲醇、體積分數(shù)為50%的甲醇、體積分數(shù)為70%的甲醇、甲醇和乙醇共5種提取溶劑；超聲和回流2種提取方法；不同提取時間(30，45和60 min)。結果表明，在提取溶劑為體積分數(shù)為30%的甲醇、超聲提取30 min的條件下，金梅清暑顆粒中的綠原酸提取率達到最佳。

本實驗方法首次建立了投料藥材為山銀花的金梅清暑顆粒的定性定量質量控制方法，結果快速、簡便、靈敏度高，為金梅清暑顆粒質量標準修訂的提升提供參考，同時也對其他含山銀花中藥制劑的質量控制提供參考依據(jù)。