姬玉露組織培養(yǎng)體系的建立

段鵬慧，焦 茹，馬 娟

（山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西太原030009）

姬玉露（Haworthia cooperi var.truncata）為百合科十二卷屬多肉植物[1-2]，原產(chǎn)南非[3]，葉片肉質(zhì)，翠綠色或淡紫色，圓潤飽滿，呈蓮座狀緊湊排列，頂端透明或半透明，形成美麗的“窗”[4]，頂部有細(xì)絲，中下部有深色的線狀脈紋，光線較強(qiáng)時，脈紋為棕紅色。近年來，多肉植物風(fēng)靡全國，成為植物新寵，對多肉植物的需求短時間內(nèi)激增，尤其是玉露類，其株型奇特美麗，清新典雅，常用作居家、辦公場所的小型盆栽裝飾物，是多肉植物中的極品，市場價格昂貴。

姬玉露一般采用種子繁殖和分株繁殖，但繁殖系數(shù)較低，生長周期長，速度較慢[5-6]，而采用植物組織培養(yǎng)方法可以較好地解決這些問題?？灯綁踇7]、毛玉露[8]、克里克特壽[9]、西山壽[10]、Haworthia mirabilis[11]、美吉壽[12]和白銀壽[13]等同屬多肉植物的組織培養(yǎng)已有報道[14-16]，但姬玉露作為新品，相關(guān)報道較少。

本試驗通過進(jìn)行外植體不同消毒時間、不同培養(yǎng)階段不同激素組合、有機(jī)添加物壯苗等研究，探索建立姬玉露組培與快繁體系，以滿足目前消費者對姬玉露的大量需求。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料來自太原市植物園溫室。選擇株型好、無病蟲害、生長健壯的姬玉露植株為母本，以姬玉露葉片作為外植體進(jìn)行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒 將姬玉露葉片從基部小心切下，用飽和洗衣粉水清洗干凈，在自來水下流水沖洗30 min。在超凈工作臺中，用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%HgCl2進(jìn)行常規(guī)消毒處理，消毒時間分別為 5，7，9，11 min，然后用無菌水沖洗 5 次，每次沖洗2 min。將葉片上的新傷口切去，立刻接種于MS＋25 g/L蔗糖＋7 g/L瓊脂培養(yǎng)基上，每個處理接種20瓶，每瓶1個外植體。接種后10～20 d統(tǒng)計外植體的污染率、成活率，分析不同消毒時間的消毒效果。

1.2.2 誘導(dǎo)愈傷組織 選取未污染的姬玉露無菌材料，接種至MS基本培養(yǎng)基添加激素的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，研究細(xì)胞分裂素（6-BA，KT）和生長素NAA對姬玉露誘導(dǎo)愈傷組織的影響。激素組合設(shè)置6個處理，每個處理接種20瓶，每瓶2個無菌外植體，15 d后觀察葉片啟動情況，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 叢生芽增殖培養(yǎng) 增殖培養(yǎng)基以MS＋NAA 0.1 mg/L為基礎(chǔ)，分別添加1.0，0.8，0.5 mg/L細(xì)胞分裂素6-BA和KT，探究不同激素不同濃度對姬玉露叢生芽增殖的影響。將初代培養(yǎng)中長出來的小苗進(jìn)行分割，切成單株小苗后接種于增殖培養(yǎng)基上。每個處理接種10瓶，每瓶3個。30 d后，觀察叢生芽增殖情況并統(tǒng)計增殖倍數(shù)。

1.2.4 壯苗培養(yǎng) 將分化出的姬玉露叢生苗切分為單株小苗，接種于添加不同質(zhì)量濃度（0，10，20，30 g/L）馬鈴薯泥的壯苗培養(yǎng)基MS＋0.8 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LNAA上。每處理10瓶，每瓶3株。30 d后，觀察記錄姬玉露生長情況，研究馬鈴薯泥對姬玉露生長情況的影響。

1.2.5 生根誘導(dǎo) 將壯苗培養(yǎng)30～35d長出的1cm以上的健壯苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)，以1/2 MS＋2 g/L活性炭為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，生長素IBA設(shè)置4個質(zhì)量濃度，分別為 0，0.03，0.05，0.10 mg/L。每處理 10 瓶，每瓶3株。30 d后觀察生根情況，統(tǒng)計生根率。

1.2.6 馴化移栽 選擇生長健壯、根系良好的姬玉露小苗，移入溫室，打開瓶蓋煉苗，3～5 d后，小心取出瓶苗，用清水洗凈根部粘附的培養(yǎng)基，于通風(fēng)處晾干，1～2 d后移栽到已經(jīng)消毒的基質(zhì)中，研究珍珠巖+粗河沙＋泥炭（體積比為1∶2∶2）、粗河沙＋泥炭（體積比為2∶1）、粗河沙3種基質(zhì)對姬玉露組培苗移栽成活率的影響。移栽后，放在通風(fēng)、有散射光的環(huán)境，保持溫度15～28℃，空氣濕度70%～90%，嚴(yán)格控制土壤濕度（見干見濕，寧干勿濕）。20 d后每種基質(zhì)隨機(jī)選取20株幼苗，統(tǒng)計生根率、根長及發(fā)育情況。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基附加瓊脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8。培養(yǎng)溫度（20±2）℃，濕度50%～60%，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時間12 h/d。生根培養(yǎng)、馴化移栽階段光照強(qiáng)度3 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 0.1%HgCl2不同消毒時間對姬玉露外植體消毒效果的比較

姬玉露葉片含水多，消毒難度大。本研究每處理接種20個外植體，由表1可知，0.1%HgCl2對姬玉露葉片進(jìn)行消毒處理，隨著消毒時間的加長，污染率逐漸降低。其中，11 min消毒處理的污染率最小，為20%，9 min消毒處理次之，污染率為25%，這2種處理的污染主要發(fā)生在接種后的前10 d；5 min消毒處理的材料污染率高達(dá)70%，接種20 d內(nèi)持續(xù)有污染現(xiàn)象。處理時間加長降低了污染程度，成活率在逐漸提高。4種處理中，9 min消毒處理的姬玉露外植體成活率最高，是70%；11 min消毒處理中有2株材料未染菌，但葉片呈黃色枯萎狀，是由于過度消毒導(dǎo)致材料死亡。因此，綜合考慮污染率、成活率指標(biāo)，9 min消毒處理適宜用于姬玉露葉片外植體的消毒。

表1 0.1%HgCl2不同消毒時間對姬玉露外植體的消毒效果

2.2 不同激素組合及濃度對姬玉露葉片啟動的影響

初代培養(yǎng)15 d后，葉片基部開始膨大，出現(xiàn)不規(guī)則黃綠色疏松的突起，無組織結(jié)構(gòu)，生長速度迅速，30 d左右形成大塊愈傷組織。由表2可知，在相同質(zhì)量濃度6-BA，NAA培養(yǎng)基中添加1 mg/L KT后，葉片愈傷組織誘導(dǎo)率為不含KT培養(yǎng)基的2.9～6.4倍，啟動效果明顯提高，說明6-BA，KT與NAA配合使用更有助于誘導(dǎo)產(chǎn)生姬玉露愈傷組織。KT和NAA的添加量分別為1，0.2mg/L時，添加1mg/L 6-BA誘導(dǎo)愈傷組織的數(shù)量是添加2 mg/L 6-BA誘導(dǎo)組織數(shù)量的4.57倍；而當(dāng)6-BA，KT用量相同時，0.1mg/L的NAA誘導(dǎo)效果又好于0.2 mg/L的NAA，說明高濃度6-BA，NAA對姬玉露葉片出愈具有一定抑制作用。當(dāng)6-BA，KT和NAA用量分別為1，1，0.1 mg/L時，姬玉露葉片產(chǎn)生的愈傷組織最多，誘導(dǎo)率達(dá)87.5%，效果最佳。

表2 不同激素組合及濃度對姬玉露葉片啟動的影響

2.3 不同激素不同濃度對姬玉露叢生芽增殖的影響

愈傷組織在原培養(yǎng)基中保持培養(yǎng)約20 d，可見愈傷組織表面出現(xiàn)綠色芽點。30 d后芽點處長出第1片新葉，繼續(xù)培養(yǎng)，每7 d左右都會生長出一片新葉，形成叢生芽。將叢生芽分成單株小苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)，30 d后生成叢狀苗。由表3可知，6-BA在姬玉露增殖培養(yǎng)中的作用較KT明顯，平均增殖倍數(shù)都在5.7以上，且叢生苗健壯，葉片大，生長舒展，葉色正常。而KT處理的平均增殖倍數(shù)最高僅為4.6，且苗細(xì)弱，色淺。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0，0.8 mg/L時，姬玉露叢生芽增殖較多，生長健壯，但是1.0 mg/L 6-BA處理會產(chǎn)生輕微玻璃化現(xiàn)象，直接影響芽苗質(zhì)量；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時，叢生芽增殖量略顯遜色，葉片較0.8 mg/L處理的葉片小。所以，MS＋0.8 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA是姬玉露叢生芽增殖的最適培養(yǎng)基。

表3 不同激素濃度對姬玉露叢生芽增殖的影響

2.4 馬鈴薯泥對姬玉露壯苗生長的影響

表4 馬鈴薯泥對姬玉露壯苗生長的比較

添加馬鈴薯泥進(jìn)行姬玉露壯苗培養(yǎng)30 d后，馬鈴薯泥對姬玉露組培苗的生長狀態(tài)有較大影響。由表4可知，添加馬鈴薯泥的組培苗普遍比未添加馬鈴薯泥的健壯，隨著使用量加大，植株的直徑、高度均有所增加，效果明顯。添加20，30 g/L馬鈴薯泥時幼苗生長狀態(tài)基本相同，為節(jié)約成本，選擇添加20 g/L馬鈴薯泥為最適壯苗有機(jī)附加物。

2.5 IBA對姬玉露誘導(dǎo)生根的影響

表5 IBA對姬玉露誘導(dǎo)生根的影響

將1 cm以上的健壯姬玉露組培苗接種至含不同濃度IBA的培養(yǎng)基中，15 d后陸續(xù)開始萌出根尖，30 d生根情況表明（表5），不含IBA的生根培養(yǎng)基，姬玉露生根率較低，僅為33.3%，且發(fā)根需要23 d，時間較長。含有IBA的培養(yǎng)基對組培苗生根均有較好的促進(jìn)作用，根粗壯，質(zhì)量高，生根率均有所提升，分別達(dá)到86.7%，86.7%和90%。但隨著IBA濃度增加，發(fā)根時間逐漸延長。與0.03 mg/LIBA處理組培苗生根情況相比，0.05 mg/L IBA處理的生根率相同（86.7%），但生根時間延長了6 d；雖然0.1 mg/L IBA處理的生根率最高（90%），但生根時間（25 d）最長，比0.03 mg/L IBA處理的生根時間整整多10 d。綜合考慮，1/2 MS＋0.03 mg/L IBA＋2 g/L活性炭為最適宜姬玉露組培苗生根培養(yǎng)基。

2.6 不同移栽基質(zhì)對姬玉露幼苗生根的影響

移栽后10 d左右姬玉露幼苗便開始長新根，20 d后多數(shù)幼苗都會發(fā)出新根，根長1～3 cm。由表6可知，粗河沙＋泥炭、粗河沙2種基質(zhì)中，幼苗生根率均為95%，比珍珠巖＋粗河沙＋泥炭基質(zhì)的生根率（75%）高。粗河沙+泥炭基質(zhì)中的幼苗健壯，新根數(shù)量多（多為3條根），根較長（平均2.69 cm）；而粗河沙中新根數(shù)量少，細(xì)弱，長勢不良。因此，粗河沙∶泥炭體積比為2∶1的基質(zhì)是姬玉露組培苗移栽的最適基質(zhì)。

表6 IBA對姬玉露誘導(dǎo)生根的影響

3 結(jié)論與討論

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，其用量雖極少，但對外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和器官分化卻起著重要的調(diào)節(jié)作用[17-18]。在一定范圍內(nèi)，植物激素濃度升高，對植物的促進(jìn)作用增強(qiáng)，當(dāng)超過這一范圍后，濃度再升高，就會對植物產(chǎn)生抑制作用[19]。本試驗結(jié)果表明，同等條件下，2 mg/L 6-BA，0.2 mg/L NAA的葉片誘導(dǎo)率均比低濃度1.0 mg/L6-BA，0.1 mg/LNAA的誘導(dǎo)作用差。同時，多種激素協(xié)同作用效果要遠(yuǎn)大于一種激素單獨使用效果[20]，KT，6-BA與NAA混和使用，有效地提高了姬玉露葉片出愈率，是同種濃度6-BA單獨與NAA作用葉片出芽率的2.9～6.4倍。姬玉露葉片啟動培養(yǎng)基以MS＋1mg/L6-BA＋1mg/LKT＋0.1mg/L NAA＋7 g/L瓊脂＋30 g/L蔗糖為宜。

姬玉露叢生芽增殖過程中，6-BA的增殖效果優(yōu)于激動素KT。6-BA在0.5～1.0mg/L范圍內(nèi)，隨著濃度增加，叢生芽增殖倍數(shù)也增加，但是由于細(xì)胞分裂速度加快，出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象，應(yīng)適當(dāng)控制叢生芽增殖數(shù)量，因此，選擇MS＋0.8 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LNAA作姬玉露叢生芽增殖培養(yǎng)基，增殖倍數(shù)可達(dá)6.1。生根培養(yǎng)選用培養(yǎng)基1/2 MS＋0.03 mg/L IBA＋2 g/L活性炭，15 d開始生根，生根率為86.7%。

馬鈴薯塊莖中含有多種氨基酸，如賴氨酸、蛋氨酸以及多種維生素等，能為植物提供營養(yǎng)元素，對試管苗在株高、葉數(shù)、根數(shù)、鮮質(zhì)量等方面有明顯促進(jìn)作用，適合試管苗的生長發(fā)育[21]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，20 g/L馬鈴薯泥可以有效促進(jìn)姬玉露生長，植株健壯，株高、直徑均有明顯提高。

姬玉露移栽管理同樣重要。姬玉露移栽選用透氣良好、排水良好、不易結(jié)塊的基質(zhì)，試驗中以粗河沙∶泥炭體積比為2∶1的基質(zhì)作為最優(yōu)選擇。目前，生產(chǎn)中，還選用專用多肉植物栽培土，如（麥飯石+火山巖+輕石+虹彩石）∶泥炭體積比為3∶1，效果也較好。商品銷售時，還會用大顆粒赤玉土作鋪面裝飾。多肉植物栽培管理要嚴(yán)格控制環(huán)境條件，必須通風(fēng)良好、有散射光，溫度在15～28℃，不宜長時間高溫暴曬。嚴(yán)格控制水分，可以預(yù)防徒長，保持株型美觀。新上盆或長勢較弱的植株不需要施肥，待植株長勢比較旺盛后每月可施一次液肥或緩釋肥，以確保植株健康生長。