茶園土壤中優(yōu)勢(shì)菌株棘孢曲霉的分離與鑒定

宋加艷 ，周小露 ，劉麗明 ，趙幸運(yùn) ，石 悅 ，周才碧

（1.黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州都勻558000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410000）

貴州省茶葉種植面積約46.7萬(wàn)hm2，是全國(guó)種植茶葉面積最大的省份，其中，黔南州的種植面積為10.7萬(wàn)hm2，也是貴州省比較重要的茶區(qū)之一。黔南州在《關(guān)于進(jìn)一步加快推進(jìn)茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見(jiàn)》中明確提出有機(jī)茶今后的發(fā)展目標(biāo)，以及在有機(jī)茶園建設(shè)中，必須提高無(wú)害化有機(jī)肥的投入使用。有機(jī)肥是特定的微生物與經(jīng)過(guò)腐熟等工藝流程的農(nóng)作物秸稈復(fù)合而形成的微生物有機(jī)肥料，其具有無(wú)毒性、肥效高、成本低、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)。

茶樹(shù)生長(zhǎng)必需的養(yǎng)分大部分是土壤供給的，但土壤中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)只能通過(guò)施肥來(lái)補(bǔ)充。長(zhǎng)期大量施用化肥，容易導(dǎo)致土壤板結(jié)、酸化、地下水硝酸鹽含量超標(biāo)以及土壤基礎(chǔ)肥力下降等問(wèn)題。施用化肥也是茶葉有害物質(zhì)超標(biāo)的主要原因之一，特別是含鉛、汞等化肥引起的重金屬超標(biāo)。

相關(guān)研究表明，貴州茶區(qū)存在不同程度的土壤酸化、重金屬超標(biāo)、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題。如都勻茶區(qū)pH值3.50～4.00，土壤嚴(yán)重酸化[1-2]；湄潭和鳳岡茶區(qū)pH值在4.00～4.50，土壤酸化；正安茶區(qū)pH值在4.00～5.00，土壤有酸化趨勢(shì)；云霧區(qū)存在嚴(yán)重的Cd和Hg污染[3]；貴定縣有2個(gè)茶園土壤處于輕污染狀態(tài)，8個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)處于警戒限范圍[3-5]；貴州省約9個(gè)市茶區(qū)鉛[6]、氯氰菊酯等重金屬均有不同程度的檢出，但沒(méi)有超標(biāo)。

施用化肥是一種給茶樹(shù)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效途徑，能為茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育提供充足的營(yíng)養(yǎng)成分，又可在一定程度上改良土壤。土壤是植物吸收養(yǎng)分的主要來(lái)源之一，通過(guò)給茶樹(shù)施肥能改良茶樹(shù)因缺少大量元素帶來(lái)的葉片發(fā)黃等問(wèn)題。茶樹(shù)專用有機(jī)肥，速效與緩效養(yǎng)分協(xié)調(diào)、肥料利用率比較高，可以減輕氮肥造成的硝酸鹽積累以及磷鉀肥造成的污染，其既可作基肥又可作追肥，將成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的必然選擇。因此，都勻毛尖茶區(qū)專用有機(jī)肥菌種資源的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用具有極其重要的意義。

本試驗(yàn)以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，分離、純化得到優(yōu)勢(shì)菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)鑒定和分子鑒定，旨在明確優(yōu)勢(shì)菌株的種屬關(guān)系，為其在茶園專用有機(jī)肥的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 供試土樣采集于貴州省黔南州都勻市三江堰茶園。

1.1.2 試劑與儀器 蔗糖（化學(xué)純，貴陽(yáng)中川化工有限公司），磷酸二氫鉀（分析純，壽光市艾益農(nóng)生物科技有限公司），七水合硫酸鎂（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），氯化鉀（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠），瓊脂粉（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)責(zé)任有限公司），七水合硫酸亞鐵（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），硝酸鈉（分析純，貴陽(yáng)中川化工有限公司）等。

電子顯微鏡（XSP-8C，德卡精密量?jī)x有限公司），電子天平（LTI000B，常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司），恒溫培養(yǎng)箱（BIC-250，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），超凈工作臺(tái)（SW-CJ1FDA，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），高壓蒸汽滅菌鍋（GI54DS，致微儀器有限公司），冰箱（BCD-251WBSV，上海帝覽實(shí)業(yè)有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 參考周才碧等[7]的方法，按試驗(yàn)要求進(jìn)行適當(dāng)修改。PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂粉20 g。WA培養(yǎng)基：瓊脂粉13 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2.2 菌株分離培養(yǎng) 稱取20 g茶園土樣放入三角瓶，加入80 mL無(wú)菌水，搖勻制備成菌種懸液，并將其稀釋成不同濃度菌種溶液備用。再用接種環(huán)蘸取不同稀釋濃度的菌種懸浮液1～2滴，采用涂布法接種于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋濃度6個(gè)重復(fù)；將PDA培養(yǎng)基放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6～7 d，有菌落形成時(shí)，即對(duì)菌株進(jìn)行純化處理。

1.2.3 菌株純化培養(yǎng) 待培養(yǎng)基上的菌落培養(yǎng)6 d可以明顯觀察到菌落時(shí)，挑選生長(zhǎng)旺盛的菌落，用平板劃線法接種到PDA培養(yǎng)基上；并將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出較多時(shí)，繼續(xù)劃線純化，直到純化出單一菌落。

1.2.4 菌株形態(tài)特征觀察 利用電子顯微鏡對(duì)菌種菌落的孢子囊、分生孢子、厚垣孢子及生長(zhǎng)速率等形態(tài)特征進(jìn)行觀察記錄，以對(duì)該菌種菌落的類型進(jìn)行初步判斷。

1.2.5 菌株生長(zhǎng)速率測(cè)定 在無(wú)菌環(huán)境下，把優(yōu)勢(shì)菌株打成直徑為5 mm的菌餅，再轉(zhuǎn)移至25℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d，量取菌落直徑并再次記錄其特征。

1.2.6 菌株分子生物學(xué)鑒定

1.2.6.1 DNA的提取 挑取約1 mg優(yōu)勢(shì)種菌絲，研磨，依次加入500μL裂解液、150μLKAC和50μL異丙醇，反復(fù)離心15 min；收取上清液，加等體積70%的乙醇，離心10 min；等待水分散失，加0.1×TE 30 μL，收集上清液得優(yōu)勢(shì)種菌絲DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，紫外分光光度法檢測(cè)DNA的濃度，再稀釋至30～50 ng/μL，備用。

1.2.6.2 PCR擴(kuò)增 用于引物篩選的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為 25 μL：1 μL DNA 模板，10×Buffer的緩沖液體 2.5 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物各1 μL，ExTaq DNA聚合酶 0.1 μL和 ddH2O 17.4 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50～60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循環(huán)32次；最后72℃延伸5 min；12℃保存?zhèn)溆?。以通用引?ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成）為引陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，4℃冰箱保存PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到測(cè)序公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所得序列提交到National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò) BLAST 程序，將28SrDNA序列與GeneBank中的核酸序列進(jìn)行對(duì)照，并從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得相關(guān)序列。采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，確定菌株類別。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)菌株的分離、純化

以優(yōu)質(zhì)土壤為材料，利用稀釋涂布分離得到5種菌；進(jìn)一步利用平板劃線純化該菌株，最終得到優(yōu)勢(shì)菌株S1（圖1-A），該菌株在25℃的PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)。

2.2 目標(biāo)菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的方法，對(duì)分離、純化得到的菌株進(jìn)行觀察。

通過(guò)肉眼觀察，菌絲體為白色，在培養(yǎng)基表面葡匐向上生長(zhǎng)，是氣生菌絲中的繁殖菌絲。利用電子顯微鏡觀察，優(yōu)勢(shì)菌種形態(tài)特征鮮明，容易識(shí)別，其菌落較大，菌絲體向上生長(zhǎng)出孢子體，孢子體為圓形，褐色。根據(jù)菌株的菌落和孢子形態(tài)等特征，初步推斷該菌屬為棘孢曲霉（圖1）。

2.2.2 分子鑒定 以棘孢曲霉菌株DNA為模板，用通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增得到1條646 bp的清晰條帶（圖 2）。

將PCR產(chǎn)物測(cè)序后提交到GenBank中，經(jīng)BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，病原真菌的rDNA-ITS序列與Phytophthora nicotianae（MG496018.1）的序列相似度高達(dá)99%。依據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3），表明該菌應(yīng)歸為Aspergillus aculeayus。結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，確定其為曲霉屬中的棘孢曲霉。

棘孢曲霉（Aspergillus aculeayus）的具體分類地位如下：

3 結(jié)論與討論

土壤是微生物的大本營(yíng)，天然棲息地[8]。土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)植物多樣性和生產(chǎn)力的重要驅(qū)動(dòng)者，直接參與了植物獲得養(yǎng)分和土壤養(yǎng)分循環(huán)2個(gè)過(guò)程[9]。本試驗(yàn)以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，進(jìn)行稀釋，并將樣品懸液涂布于培養(yǎng)皿培養(yǎng)得出多種菌種，又對(duì)菌種進(jìn)行分離，再挑取菌種純化得到優(yōu)勢(shì)菌株。為了明確優(yōu)勢(shì)菌株的種屬關(guān)系，首先對(duì)于優(yōu)勢(shì)菌株的鑒定主要采用傳統(tǒng)的生物形態(tài)學(xué)鑒定法，利用電子顯微鏡進(jìn)行觀察[10]，初步確定該優(yōu)勢(shì)菌株為曲霉屬；其次，對(duì)于優(yōu)勢(shì)菌株采用ITS序列（分子）鑒定法，確定其為棘孢曲霉。

棘孢曲霉JMUdb058固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的能力突出，是一種高產(chǎn)柚苷酶[11]、β-葡萄糖苷酶[12]的微生物新資源。從土壤真菌棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）中分離得到2個(gè)新化合物和2個(gè)已知化合物，活性測(cè)試結(jié)果表明，4個(gè)化合物均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性[13]。