雜交狼尾草腋芽的離體培養(yǎng)與組培快繁技術(shù)

蘇 艷 ，楊寶明 ，黃玉玲 ，李永平 ，王麗花 ，龍 媛 ，張藝萍

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，農(nóng)業(yè)部花卉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（昆明），國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南昆明650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南昆明650205；3.屏邊縣新華鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，云南屏邊661205）

雜交狼尾草（Pennisetum americanum×Pennisetum.purpeum）是以二倍體美洲狼尾草和四倍體象草交配產(chǎn)生的三倍體雜種，其屬熱帶植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶南部地區(qū)，具有較強的抗倒伏、抗病、抗旱和保水能力，又具有一定的耐濕和耐鹽能力，產(chǎn)量高，耐收割，供青時間長[1-3]；蛋白質(zhì)含量高，適應(yīng)地區(qū)廣，是適合飼喂牛、羊、魚等多種草食畜禽的優(yōu)質(zhì)青飼料作物[4-5]。然而，雜交狼尾草不耐寒，不能自然越冬，只能作1年生栽培，而且種子不育，只能用根或莖稈進行無性繁殖，但根和莖稈數(shù)量有限，種苗的供給問題嚴(yán)重制約了雜交狼尾草在我國寒冷地區(qū)的推廣應(yīng)用[1-4]。

本試驗以雜交狼尾草莖節(jié)處的飽滿腋芽為繁殖材料，通過誘導(dǎo)腋芽、繼代增殖培養(yǎng)以及生根壯苗3個步驟進行試驗研究，旨在以簡單、有效的方法，探索快速培育雜交狼尾草優(yōu)良種苗的方法[6-25]，以促進雜交狼尾草的進一步開發(fā)和利用，為雜交狼尾草的組培產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料是于2017年6月采自貴州畢節(jié)市大田種植的雜交狼尾草莖稈。

1.2 方法

1.2.1 外植體選擇 選擇生長健壯、長勢良好、分蘗多、產(chǎn)量高、無病蟲害、當(dāng)年生中上部幼嫩莖稈作為外植體。

1.2.2 外植體處理 選取葉鞘包裹緊實、距頂端4～5節(jié)的莖段，保留葉鞘，去除葉片，并用肥皂水刷冼干凈，然后用自來水沖洗2～3 h。

1.2.3 外植體滅菌 剝除葉鞘，選擇腋芽飽滿的莖節(jié)，以莖節(jié)為中心，兩端各留1 cm切取莖節(jié)。在無菌工作臺內(nèi)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的HgCl溶液浸泡15 min，無菌水沖洗5～6次，再用無菌濾紙吸干表面水分，備用。

1.2.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 以MS＋庶糖30 g/L＋瓊脂粉5 g/L為基本培養(yǎng)基，pH值5.8～6.0。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：（1）MS＋KT 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（2）MS＋KT1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（3）MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（4）MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA0.2 mg/L；（5）MS＋KT2.0 mg/L＋NAA 0.4 mg/L；（6）MS＋6-BA2.0 mg/L＋NAA0.4 mg/L。

增殖培養(yǎng)基為：（7）MS＋KT 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（8）MS＋KT 2.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（9）MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA0.1 mg/L；（10）MS＋6-BA 2.5 mg/L＋NAA0.1 mg/L；（11）MS＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（12）MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L；（13）MS＋6-BA3.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L；（14）MS＋6-BA4.0 mg/L＋NAA0.3 mg/L。

生根培養(yǎng)基為：（15）MS＋NAA 0.2 mg/L；（16）MS＋NAA 0.4 mg/L；（17）MS＋IBA 0.5 mg/L；（18）MS＋IBA0.2 mg/L；（19）MS＋IBA0.4 mg/L；（20）MS＋IBA0.5 mg/L。

以上各階段，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時間為12 h/d，光照強度為1 600～2 000 lx。

1.2.5 外植體腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 將無菌腋芽從莖節(jié)處切下（帶部分莖節(jié)組織，不要損傷腋芽），接種于外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1）～（6）中進行培養(yǎng)，25 d時觀察統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.6 芽叢增殖培養(yǎng) 將誘導(dǎo)培養(yǎng)所得芽叢，按1～2個芽為一叢進行分割后，接種到叢生芽增殖培養(yǎng)基（7）～（14）中進行培養(yǎng)。每處理接種9瓶，每瓶接種5叢，25 d時觀察統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.7 生根壯苗培養(yǎng) 選擇叢生芽中生長健壯、長勢良好、高度達3 cm左右的小苗，從其基部切成單芽，接種到生根培養(yǎng)基（15）～（20）中進行培養(yǎng)。每處理接種12瓶，每瓶接種10株，15 d時統(tǒng)計生根情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對雜交狼尾草外植體腋芽誘導(dǎo)的影響

由表1可知，將外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基6 d后，可觀察到（6）號培養(yǎng)基中的部分腋芽開始萌動，（1）～（5）號培養(yǎng)基接種8 d后部分腋芽才開始萌動，（1）～（6）號培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)。從總體情況看，不定芽的分化效果隨著6-BA，KT以及NAA質(zhì)量濃度的增加，芽的萌動時間縮短，芽的分化數(shù)量隨之增加，6-BA的誘導(dǎo)效果好于KT。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.0 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時，腋芽萌動最早、芽分化數(shù)量最多，每個腋芽平均產(chǎn)生叢生芽3.53個。因此，MS＋6-BA2.0 mg/L＋NAA 0.4 mg/L是最適合雜交狼尾草腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

表1 不同激素和質(zhì)量濃度對雜交狼尾草外植體腋芽誘導(dǎo)的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對雜交狼尾草不定芽增殖的影響

由表2可知，在繼代增殖培養(yǎng)過程中，不同質(zhì)量濃度的6-BA，KT與不同質(zhì)量濃度的NAA配合使用對芽增殖的效果有所不同。其中，6-BA和KT都能促進芽增殖，并隨著6-BA和KT質(zhì)量濃度的增加芽的分化數(shù)量增加。從整體上看，在相同質(zhì)量濃度下，6-BA促進芽分化的效果明顯好于KT，更有利于芽的增殖。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度達到4 mg/L時，芽的分化數(shù)量反而減少，芽叢不生長，芽的高度下降，說明高質(zhì)量濃度的6-BA會抑制芽的生長；另外，NAA質(zhì)量濃度太低不利于芽的分化和伸長。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2～3 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.3 mg/L時，芽的增殖數(shù)量最多，生長速度最快，芽整齊、粗壯。因此，增殖培養(yǎng)基以MS＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA0.3 mg/L為最佳。

表2 不同培養(yǎng)基對雜交狼尾草不定芽增殖分化的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對雜交狼尾草苗生根的影響

由表3可知，在培養(yǎng)基中添加NAA或IBA都能誘導(dǎo)生根，不同處理對不定根的誘導(dǎo)能力不同。其中，（17號）和（20號）2個培養(yǎng)基，生根效果最好，生根率均為100%。添加NAA的培養(yǎng)基生根相對較快，接種10 d后開始產(chǎn)生根原基，15 d左右開始有根系長出，根系粗、多、整齊，但根短、脆；添加IBA的培養(yǎng)基生根相對要慢，根原基不明顯，18 d左右才開始生根，根系相對較少、整齊度較差，但根系粗細適中、柔軟。從馴化煉苗成活率考慮，生根培養(yǎng)基以MS＋IBA0.5 mg/L為最佳。

表3 不同培養(yǎng)基對雜交狼尾草芽生根的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗以雜交狼尾草植株中上部莖節(jié)（帶飽滿腋芽）為外植體，易滅菌、接種污染率、褐化率低；直接誘導(dǎo)腋芽分化，誘導(dǎo)時間短，芽萌動早，生長快，較易獲得無菌繁殖體系。激素的種類、濃度和組合是影響外植體誘導(dǎo)和植株再生的關(guān)鍵因素，本試驗結(jié)果表明，無論是外植體的誘導(dǎo)或芽叢的增殖，6-BA和NAA組合的效果好于6-BA和IBA，過高或過低的質(zhì)量濃度的6-BA和NAA都不利于腋芽的誘導(dǎo)和叢生芽的增殖，6-BA的質(zhì)量濃度為2～3 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.2～0.4 mg/L時有利于芽的增殖。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為4 mg/L對芽的生長有抑制作用，芽多但生長較慢。另外，通過本試驗還發(fā)現(xiàn)，雜交狼尾草在增殖培養(yǎng)過程中極易發(fā)生褐化，隨著培養(yǎng)時間的延長，褐化情況會明顯加重，在20～25 d的生長周期內(nèi)進行轉(zhuǎn)接，并在培養(yǎng)基中加入活性炭（0.5 g/L），可減輕褐化現(xiàn)象的發(fā)生。說明適時轉(zhuǎn)接并在培養(yǎng)基中添加活性炭對抑制褐化現(xiàn)象十分重要。