超微粉碎輔助提取黑豆皮水溶性膳食纖維及其特性研究

喬小全 任廣躍 段 續(xù) 陳 曦 劉軍雷李葉貝 屈展平 黃 菊

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；食品加工與安全國家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，洛陽 471023)

黑大豆,異名烏豆、櫓豆、枝仔豆、冬豆子,為豆科植物大豆[Glycinemax (L.)Merr.]的黑色種子，因其具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，被賦予“豆中之王”的美譽(yù)[1]。黑大豆是傳統(tǒng)的藥食同源農(nóng)產(chǎn)品，其種皮是優(yōu)質(zhì)膳食纖維的理想來源，在改善潤腸通便以及對(duì)糖尿病、高血壓、肥胖癥、心血管疾病等慢性非傳染性疾病具有預(yù)防和保健作用[2-3]。在黑豆油的生產(chǎn)加工過程中，黑豆皮是主要的廢棄物，含有豐富的纖維素、維生素、多糖等多種營養(yǎng)物質(zhì)，充分利用黑豆皮制備水溶性膳食纖維，可彌補(bǔ)黑豆皮研究領(lǐng)域空缺，具有一定的市場價(jià)值和良好的經(jīng)濟(jì)前景[4]。

膳食纖維根據(jù)其水溶性可分成水溶性膳食纖維(Soluble Dietary Fiber，SDF)和非水溶性膳食纖維(Insoluble Dietary Fiber，IDF)兩大類[5]。馮子倩等[6]采用堿性過氧化氫法提升黑豆皮水溶性膳食纖維產(chǎn)率并探究改性后的水溶性膳食纖維具有顯著的膽酸結(jié)合能力。羅磊等[7]利用超微粉碎輔助酶法技術(shù)在提高綠豆皮水溶性膳食纖維產(chǎn)率的同時(shí)改善了其物理特性。劉博等[8]對(duì)可溶性膳食纖維的生理功能進(jìn)行了研究，表明水溶性膳食纖維具有降低血糖、血脂以及預(yù)防心血管疾病、預(yù)防腫瘤發(fā)生等多種生理功能；羅磊等[9]發(fā)現(xiàn)了綠豆皮水溶性膳食纖維具有提高機(jī)體清除自由基的能力。迄今為止，國內(nèi)外主要利用綠豆皮、癩葡萄渣、梨渣、椪柑渣、蘆筍、米糠[9-14]等原料制備水溶性膳食纖維。近年來，國內(nèi)外主要集中于對(duì)黑豆皮色素的提取及相關(guān)性質(zhì)研究，但關(guān)于以黑豆皮為原料，采用超微粉碎輔助酶水解技術(shù)制備水溶性膳食纖維鮮見報(bào)道。

超微粉碎技術(shù)具有使粉體顆粒微細(xì)化，孔隙率和比表面積增加的功能，可顯著提高膳食纖維的物化特性且對(duì)操作設(shè)備、工藝要求不高，成本相對(duì)較低[15]。酶水解技術(shù)具有降解細(xì)胞壁，有效減小提取阻力，進(jìn)而提高提取效率，縮短提取時(shí)間。此外，酶水解技術(shù)還具有操作簡單、條件溫和、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬采用超微粉碎輔助酶水解技術(shù)提取黑豆皮水溶性膳食纖維，以提高水溶性膳食纖維的產(chǎn)率，并對(duì)其特性進(jìn)行研究，為開發(fā)具有降血脂功效的食品添加劑提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆皮：蘇州市天靈中藥飲片有限公司；木瓜蛋白酶：10 U/mg、纖維素酶：50 U/mg，上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶：37 U/mg，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；膽酸鈉：分析純，上海翊圣生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；抗壞血酸(Vc)、濃硫酸、醋酸、醋酸鈉、糠醛、三乙酸、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、氯化鐵、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、水楊酸、過氧化氫、無水乙醇等：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HMB-701型超微粉碎機(jī)：北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司；HC-200型高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠；RE52-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海滬西分析儀器有限公司；UV759型紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；7GL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；PHS-25型pH計(jì)：上海雷磁儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程 1.3.1.1 黑豆皮粉樣品制備

黑豆皮→清洗→干燥→粉碎→過40目篩→黑豆皮粗粉→酶解、滅酶→干燥→黑豆皮粉樣品

1.3.1.2 黑豆皮水溶性膳食纖維的提取

黑豆皮粉樣品→纖維素酶降解→離心→濃縮→無水乙醇沉淀→離心、分離→干燥→黑豆皮SDF

1.3.2 操作要點(diǎn)

經(jīng)高速多功能粉碎機(jī)過40目篩制備黑豆皮粗粉，向其添加37 U/mg，ɑ-淀粉酶50 μL/g，在65 ℃水浴恒溫振蕩器中搖蕩1 h，滅酶10 min，冷卻，再向其添加10 U/mg木瓜蛋白酶100 μL/g[16]，在45 ℃水浴恒溫振蕩器中搖蕩2 h[17]，滅酶10 min，經(jīng)過濾、烘干至恒重，制備黑豆皮粉樣品。

將準(zhǔn)確稱量的黑豆皮粉樣品置于100 mL離心管中，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解纖維素酶后，在離心管中與樣品充分混合并振蕩，水浴溫度60 ℃條件下提取60 min，沸水浴滅酶10 min并冷卻后，于離心機(jī)4 000 r/min離心15 min，濾去殘?jiān)?，取其上清液進(jìn)行濃縮。之后，用4倍體積的無水乙醇對(duì)濃縮液沉淀2 h，離心取沉淀，干燥至恒重，即為黑豆皮水溶性膳食纖維(SDF)。

1.3.3 超微粉碎對(duì)提取黑豆皮水溶性膳食纖維的影響

準(zhǔn)確稱量黑豆皮粗粉置于超微粉碎機(jī)中粉碎，制備黑豆皮超微粉，將一次性所制得的超微粉分別過50、100、200、300、400、500目篩，獲得不同粒度的超微粉，按照1.3.1.2工藝流程制備黑豆皮水溶性膳食纖維，研究超微粉粒徑大小對(duì)產(chǎn)率的影響，并在此基礎(chǔ)，進(jìn)一步優(yōu)化酶法提取黑豆皮水溶性膳食纖維的工藝。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，預(yù)測較好的參數(shù)范圍并實(shí)施單因素實(shí)驗(yàn)，均實(shí)施3次平行實(shí)驗(yàn)[18]。

(1)液固比：固定酶解溫度、酶解時(shí)間、酶底比分別為55 ℃、2 h、0.2(U/mg)，考察液固比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1(mL/g)]對(duì)黑豆皮水溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響。

(2)酶底比：固定酶解溫度、酶解時(shí)間、液固比分別為55 ℃、2 h、30∶1(mL/g)，考察酶底比[0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35(U/mg)]對(duì)黑豆皮水溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響。

(3)酶解時(shí)間：固定酶解溫度、酶底比、液固比分別為55 ℃、0.2(U/mg)、30∶1(mL/g)，考察酶解時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)對(duì)黑豆皮水溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響。

(4)酶解溫度：固定酶解時(shí)間、酶底比、液固比分別為2 h、0.2(U/mg)、30∶1(mL/g)，考察酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對(duì)黑豆皮水溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響。

1.3.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)黑豆皮水溶性膳食纖維產(chǎn)率影響相對(duì)較大的因素為考察因素，以黑豆皮SDF產(chǎn)率為考察指標(biāo)，采用Design-Expert 8.05進(jìn)行處理與分析，得出黑豆皮SDF提取的最佳工藝條件。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 黑豆皮SDF產(chǎn)率的計(jì)算

將收集到的固體物質(zhì)置于45 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥1～2 h，蓋好蓋子取出，在干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱量。重復(fù)操作，直至前后2次的質(zhì)量差<2 mg，即為恒重，按式(1)計(jì)算黑豆皮SDF的產(chǎn)率。

(1)

式中：X為黑豆皮SDF產(chǎn)率/%；m1為黑豆皮水溶性膳食纖維的提取質(zhì)量/g；m2為黑豆皮粉樣品的質(zhì)量/g。

1.4.2 膨脹性的測定

準(zhǔn)確稱量1.0 g黑豆皮SDF粉末(m3)于干燥的50 mL量筒中，記錄其初始體積V1，然后添加蒸餾水至刻度，攪拌均勻后于室溫靜置過夜，觀察并記錄吸水后體積V2，按式(2)計(jì)算黑豆皮SDF的膨脹性[19]。

(2)

式中：SWC為黑豆皮SDF膨脹性/mL/g；V1為初始體積/mL；V2為吸水膨脹后的體積/mL；m3為試樣質(zhì)量/g。

1.4.3 持水性的測定

準(zhǔn)確稱量0.5 g黑豆皮SDF粉末(m4)置于50 mL離心管中，向其添加20 mL蒸餾水，室溫下漩渦振蕩24 h，3 000 r/min離心15 min，除去上清液并用濾紙吸干殘留水分稱量后計(jì)算為濕重M，按式(3)計(jì)算黑豆皮SDF的持水性[20]。

(3)

式中：WHC為黑豆皮SDF持水性/g/g；m4為試樣質(zhì)量/g；M為濕重/g。

1.4.4 持油性的測定

準(zhǔn)確稱量0.5 g黑豆皮SDF粉末(m5)置于經(jīng)干燥的50 mL離心管中，向其添加10 mL菜籽油，搖勻浸泡1 h，間隔10 min搖蕩一次，在3 000 r/min離心15 min，除去上清液并用濾紙吸干殘留油分，稱量剩余沉淀重量m6，按式(4)計(jì)算黑豆皮SDF的持油性[21]。

(4)

式中：OHC為黑豆皮SDF持油性/%；m5為黑豆皮SDF粉末質(zhì)量/g；m6為剩余殘?jiān)|(zhì)量/g。

1.4.5 黑豆皮SDF對(duì)膽酸鈉的體外吸附測定

測定方法參照文獻(xiàn)[22]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均用Origin 8.5與Design-Expert 8.05進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超微粉碎粒徑大小對(duì)黑豆皮SDF產(chǎn)率的影響

由圖1可知，在過50～400目篩(粒徑270～25 μm)時(shí)，黑豆皮SDF產(chǎn)率隨篩網(wǎng)目數(shù)的增大而升高。當(dāng)實(shí)驗(yàn)樣品過400目篩網(wǎng)而未過500目(粒徑25～38 μm)時(shí)，黑豆皮SDF產(chǎn)率達(dá)12.28%。可能由于經(jīng)超微粉碎后，顆粒微細(xì)化，粉體比表面積增大，進(jìn)而增大了與溶劑的接觸面積[23]，促使黑豆皮SDF的進(jìn)一步溶出；此外，黑豆皮細(xì)胞在強(qiáng)作用力下破碎更加徹底，促使進(jìn)一步降解細(xì)胞壁，增強(qiáng)其親水性，使黑豆皮SDF可直接溶于溶劑中，不用間接通過細(xì)胞膜而緩慢擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)樣品過500目篩網(wǎng)(粒徑<25 μm)，提取率為12.31%，與過400目篩網(wǎng)相比，產(chǎn)率變化較小，可能由于粒徑小的超微粉，增大粉體內(nèi)部靜電摩擦力，減弱其流動(dòng)性，加強(qiáng)其吸附作用，粉體間易出現(xiàn)黏附和結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。綜合考慮，選取過400目而未過500目(粒徑25～38 μm)的樣品開展纖維素酶酶解探究。

圖1 不同超微粉粒徑對(duì)黑豆皮SDF產(chǎn)率的影響

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，當(dāng)液固比在[10∶1～30∶1(mL/g)]時(shí)，黑豆皮SDF產(chǎn)率隨液固比的升高而呈現(xiàn)增加的趨勢。推測可能是液固比例越大，使粉體顆粒與溶劑接觸更加充分，有助于黑豆皮SDF的溶出；提取液中黑豆皮SDF質(zhì)量濃度越低，體系中傳質(zhì)推動(dòng)力就越大，進(jìn)而提升了提取速率。當(dāng)液固比大于30∶1(mL/g)時(shí)，黑豆皮SDF產(chǎn)率隨液固比增大而呈現(xiàn)平緩趨勢；另外，過高的液固比不僅造成原料的浪費(fèi)，還會(huì)增加后期處理的難度。綜合考慮，選取30∶1(mL/g)為適宜液固比。

圖2 四因素對(duì)黑豆皮SDF產(chǎn)率的影響

由圖2可知，當(dāng)酶底比在0.10～0.20(U/mg)時(shí)，黑豆皮SDF產(chǎn)率隨纖維素酶添加量的增加而增大，當(dāng)酶底比大于0.20(U/mg)時(shí)，黑豆皮SDF產(chǎn)率呈現(xiàn)下降趨勢。可能是由于適量纖維素酶作用下，促使黑豆皮SDF不斷溶出；與此同時(shí)，部分水不溶性膳食纖維發(fā)生降解，分子鏈斷裂，分子量降低，有助于水不溶性膳食纖維(IDF)轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄陨攀忱w維(SDF)；而纖維素酶添加量過多，能促使水不溶性膳食纖維降解為較低分子量的低聚糖、多糖等，因其分子量過小而不能被乙醇沉淀，進(jìn)而降低黑豆皮SDF產(chǎn)率。綜合分析，選取0.20 U/mg為適宜的酶底比。

由圖2可知，當(dāng)酶解時(shí)間在1～2 h時(shí)，隨酶解時(shí)間推移，黑豆皮SDF產(chǎn)率呈增加的趨勢；當(dāng)酶解時(shí)間大于2 h時(shí)，SDF產(chǎn)率呈下降的趨勢?？赡苡捎谠诶w維素酶作用下，充分水解，進(jìn)而提高了黑豆皮SDF產(chǎn)率；但隨著酶解時(shí)間的推移，纖維素酶作用有限，提取量接近飽和；另外，酶解時(shí)間越長，SDF所含果膠、部分半纖維素等物質(zhì)易發(fā)生降解現(xiàn)象[24]。綜合考慮，選取2 h為適宜的酶解時(shí)間。

由圖2可知，黑豆皮SDF產(chǎn)率隨酶解溫度的升高而呈先上升后下降的趨勢，在55 ℃時(shí)，產(chǎn)率達(dá)最大值。由于酶活性受溫度影響很大，過低溫度能減弱酶促反應(yīng)，而升高溫度可提高酶促反應(yīng)速度。在55 ℃時(shí)，纖維素酶活性最強(qiáng)，酶促反應(yīng)速度最大。過高的酶解溫度不僅降低酶的活性，還會(huì)增大原料提取液黏度，進(jìn)而降低黑豆皮SDF產(chǎn)率。綜合考慮，選取55 ℃為適宜的酶解溫度。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化SDF提取條件的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以液固比(X1)、酶底比(X2)、酶解溫度(X3)為實(shí)驗(yàn)因素，以黑豆皮SDF產(chǎn)率(Y)為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素五水平的二次通用旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)，對(duì)黑豆皮SDF的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因子及其水平見表1。

表1 三元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

2.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合分析各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)黑豆皮SDF產(chǎn)率的影響，以產(chǎn)率為主要指標(biāo)，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面分析。其實(shí)驗(yàn)組合及結(jié)果見表2。

表2 三元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)回歸擬合后，得到二次多項(xiàng)式回歸方程為：

Y=12.01+1.32X1+1.60X2-0.83X3-0.97X1X2-0.43X1X3-0.54X2X3-0.56X21-1.22X22-0.93X23

(5)

2.3.3 黑豆皮SDF產(chǎn)率方差分析表及響應(yīng)曲面分析

由表3可知，二次回歸模型(P=0.000 1<0.01)影響顯著，且失擬項(xiàng)(P=0.891 4>0.05)影響不顯著，回歸系數(shù)R2=0.928 0，表明該回歸模型與實(shí)際測量值擬合效果良好，可使用多項(xiàng)回歸方程代替實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。一次項(xiàng)X1、X2、X3，二次項(xiàng)X22、X23對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響特別顯著，二次項(xiàng)X21與交互項(xiàng)X1X2對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著，交互項(xiàng)X1X3、X2X3對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響均為不顯著。綜合考慮，酶底比、液固比、酶解溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響均顯著，3個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的主次依次為酶底比>液固比>酶解溫度。

表3 黑豆皮SDF產(chǎn)率方差分析表

2.3.4 優(yōu)化與驗(yàn)證

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果可知，黑豆皮SDF提取最優(yōu)工藝條件：液固比30.41∶1(mL/g)、酶底比187.81(U/mg)、溫度60.46 ℃，產(chǎn)率為12.98%?？紤]實(shí)際操作的可行性，將最優(yōu)的黑豆皮SDF提取條件修改為：液固比30∶1(mL/g)、酶底比188(U/mg)、溫度60 ℃，根據(jù)修正的最佳提取條件，實(shí)施3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到黑豆皮SDF平均產(chǎn)率為12.01%，與理論值之差<5%，表明所得模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.4 持水力、持油力和膨脹力的測定

由表4可知，黑豆皮SDF的膨脹力、持水力、持油力分別為：2.56(mL/g)、377%、138%。李夢琴等[25]采用超高壓處理小麥麩皮并提取水溶性膳食纖維(SDF)，測其膨脹力、持水力分別為1.49(mL/g)、308%；鞠健等[26]以山藥皮為原料制備水溶性膳食纖維(SDF)，測其持油性為1.30(g/g)，表明本實(shí)驗(yàn)制備的黑豆皮SDF具備良好的膨脹力、持水力和持油力。具有較高的持水力、持油力、膨脹力的水溶性膳食纖維可使人產(chǎn)生一定的飽腹感，降低食欲，進(jìn)一步控制肥胖，同時(shí)可刺激腸道蠕動(dòng)，能及時(shí)將糞便中的有害物質(zhì)排出體外，進(jìn)而降低腸道癌、痔瘡等患病風(fēng)險(xiǎn)。因此，黑豆皮SDF可在食品加工中用作食品添加劑。

表4 黑豆皮SDF膨脹力、持水力和持油力的測定

2.5 膽酸鈉的體外吸附分析

膳食纖維的降血脂功效可用其對(duì)膽酸鈉的吸附能力進(jìn)行衡量，膽固醇分解產(chǎn)物含膽酸鹽，通過借助疏水相互作用、范德華力及氫鍵等與膽酸鹽發(fā)生相互作用，或以一種作用力為主，束縛體內(nèi)膽酸鹽及促使排出體外，使其在腸肝循環(huán)過程中降低體內(nèi)膽酸鹽的積累量，膽固醇代謝得以改善，進(jìn)而可降低體內(nèi)膽固醇含量，間接發(fā)揮降血脂的功能特性[27]。由圖3可知，SDF溶液中膽酸鈉的濃度在伴隨時(shí)間的延長而降低，在最開始的30 min內(nèi)，濃度變化比較顯著，而后趨于平緩，并趨向一個(gè)定值?？赡苁怯捎赟DF含量有限，其對(duì)膽酸鈉的吸附量伴隨時(shí)間的延長，逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)，在105 min時(shí)，測其膽酸鈉質(zhì)量濃度1.402 2 g/L，清除量0.597 8 g/L，計(jì)算黑豆皮SDF對(duì)膽酸鈉吸附率為29.89%。

圖3 膽酸鈉隨時(shí)間變化的吸光度值

3 結(jié)論

利用超微粉碎輔助酶水解技術(shù)提取黑豆皮水溶性膳食纖維，并采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件，各因素對(duì)產(chǎn)率的影響為：酶底比>液固比>酶解溫度。制備黑豆皮SDF最優(yōu)工藝為：物料粒徑25～38 μm、液固比30∶1(mL/g)、酶底比188(U/mg)、溫度60 ℃、酶解2 h。該條件下，SDF平均產(chǎn)率為12.01%，膨脹力2.56(mL/g)，持水力377%，持油力138%，對(duì)膽酸鈉的吸附率達(dá)29.89%，具備一定的降血脂功效，但對(duì)制備的黑豆皮SDF分離純化及其生理功能還需進(jìn)一步的研究。