VEGF與Notch信號通路對再生障礙性貧血患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制研究

鄧姝 項(xiàng)靜靜 胡致平 沈建平 曾宇晴

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種由多種病因引起的骨髓造血功能衰竭、全血細(xì)胞減少性疾病，臨床常表現(xiàn)為貧血、出血及感染，病死率高。骨髓造血微環(huán)境的改變參與了AA的病理生理過程，并與造血衰竭程度[1]及治療反應(yīng)有關(guān)。骨髓中新生血管形成是造血微環(huán)境的重要一環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，參與新生血管形成；Notch信號通路通過影響局部細(xì)胞間的相互作用也對血管的形成產(chǎn)生重要影響。但VEGF如何影響AA患者骨髓造血微環(huán)境的作用機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究旨在觀察VEGF通過Notch信號通路對AA患者骨髓造血微環(huán)境的影響，探討VEGF與Notch信號通路對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）的調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年7月至2017年2月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的AA患者10例。其中男4例，女6例；年齡15~46歲，中位年齡26.5歲。同時招募健康骨髓造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)志愿者5例。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬及志愿者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 MSC的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定 留取AA患者與健康志愿者的骨髓標(biāo)本各5ml。骨髓標(biāo)本與DMEM（美國Hyclone公司）1：1混勻添加到淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基上（美國Sigma公司），并通過離心機(jī)（上海貝恩生物科技有限公司）分離。將骨髓單個核細(xì)胞重懸于DMEM培養(yǎng)基中，并以1×105/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)48h后更換培養(yǎng)基。每3~4d換液1次，約2周后完成原代培養(yǎng)，并依次記為P2、P3代細(xì)胞。取P3代細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測細(xì)胞免疫表型，包括 CD34、CD44、CD45、CD90 等。1.2.2 細(xì)胞分組 將MSC分為5組。正常MSC組：健康志愿者的MSC于DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。AA組：AA患者的MSC于DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。AA+γ-分泌酶抑制劑（DAPT）組：AA患者的MSC于含有10μmol/L DAPT（美國Sigma公司)的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；AA+VEGF組：AA患者的MSC于含有100ng/ml VEGF（美國Peprotech公司）的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；AA+DAPT+VEGF組：AA患者的 MSC于含有10μmol/LDAPT和100ng/ml VEGF的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測 使用CCK-8試劑盒（中國碧云天公司）檢測各組MSC的增殖能力。將各組MSC接種在 96孔板（100μl/孔）中，并在 37℃、5%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)直至完全黏附。處理48h后，向每孔中加入10μl CCK-8溶液并孵育2h。應(yīng)用酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）檢測450nm處的光密度（OD值）以反映細(xì)胞增殖能力。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測 應(yīng)用流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測各組MSC的細(xì)胞周期。以1500rpm離心5min收集細(xì)胞，并用冷PBS洗滌2次。在細(xì)胞周期檢測過程中，將經(jīng)消化的MSC用5ml 70%冷乙醇溶液在4℃下固定，過夜；用冷PBS洗滌2次，將這些細(xì)胞與0.5ml碘化丙啶（PI，美國Sigma公司）在黑暗環(huán)境中孵育20min，最后在流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞的細(xì)胞周期。

1.2.5 相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。收集各組細(xì)胞，PBS漂洗2次，細(xì)胞裂解液（中國碧云天公司）4℃環(huán)境下裂解細(xì)胞 30min，12000rpm 4℃離心10min，使用BCA蛋白濃度測定試劑（中國碧云天公司）檢測蛋白含量。取30μg蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAG，北京普利萊基因技術(shù)公司）電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉室溫封閉1h。一抗孵育，于4℃環(huán)境中過夜，用TBST（上海百賽公司）洗膜3次，加入二抗室溫孵育1h后，再用TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，檢測VEGF蛋白與Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，包括 VEGF、VEGFR、Cleaved Notch-1、Notch-1、Jagged1、Delta-like1、hes1。

1.2.6 相關(guān)基因表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。收集正常MSC組與AA組細(xì)胞，嚴(yán)格按照Trizol試劑盒（北京全式金公司）說明書操作提取總RNA。取100ng總RNA，采用PrimeScipt逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37℃ 60min，85℃ 5s，逆轉(zhuǎn)錄完成后進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件為50℃ 2min，預(yù)變性95℃ 30s，PCR 反應(yīng) 95℃ 5s，60℃ 30s，40 個循環(huán)，熔解反應(yīng)條件為95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。引物序列如下：VEGF 上游 5′-ACTTTCTGCTGTCTTGGGTG-3′，下游 5′GGCTTGAAGATGTACTCGAT-3′；VEGFR 上游 5′-TCCTGACTTGTACCGCATAT-3′，下游 5′-CTCTCAATTCTGTTTCCCAT-3′；Notch-1 上游 5′-TGGCCTCCTTCTACTGCGAG-3′，下游 5′-CAGTTGGAGCCCTCGTTACA-3′；Jagged1 上游 5′-CGGATTTAAGTGTGTGTGCC-3′，下游 5′-CGGGAAGACAGTCGCAGTAG-3′；Delta-like1 上游 5′-TCTCCTGATGACCTCGCA AC-3′，下游 5′-GTCACA-CACGAAGCGGTAGG-3′；hes1 上游5′-GATCTTTGC-TCCTGACGTCC-3′，下游 5′-CCTTGCAATCTTTCCCGTCC-3′；GAPDH 上游 5′-GCCTTCCGTGTCCCCACTGC-3′，下游 5′-GGCTGGTGGTCCAGGGGTCT-3′。反應(yīng)結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，并分析VEGF與Notch信號通路相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.7 內(nèi)皮分化能力檢測 采用免疫熒光法。吸棄正常MSC組、AA組、AA+DAPT組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加PBS清洗2次；用4%多聚甲醛固定各組細(xì)胞，4℃環(huán)境下過夜，PBS 清洗 3 次，各 5min；1%TritonX-100（上海朝瑞公司，PBS配制）孵育1次 15min，PBS清洗1次，5min；孵育 10min，PBS清洗 1次，5 min；5%牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma公司）封閉30min，配制一抗稀釋液（1：100）CD31一抗4℃環(huán)境下過夜；PBS清洗3次，各5 min，37℃孵育 2h；PBS 清洗 3 次，各 5min，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，中國碧云天公司）染核5~10min，PBS洗3次，熒光顯微鏡拍照，比較細(xì)胞內(nèi)皮分化能力。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較AA患者與健康志愿者M(jìn)SC免疫表型；（2）比較正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC增殖能力、細(xì)胞周期情況、VEGF蛋白與Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況；（3）比較AA組與正常MSC組MSC VEGF與Notch信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況；（4）比較正常MSC組、AA組、AA+DAPT組MSC內(nèi)皮分化能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AA患者與健康志愿者M(jìn)SC免疫表型比較見表1。

表1 AA患者與健康志愿者M(jìn)SC免疫表型比較（%）

由表1可見，AA患者與健康志愿者M(jìn)SC免疫表型比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC增殖能力比較見圖1。

圖1 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF（*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖1可見，正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC細(xì)胞增殖能力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AA組MSC增殖能力弱于正常MSC組（P＜0.05），AA+VEGF組MSC增殖能力強(qiáng)于AA組（P＜0.05）。即AA患者M(jìn)SC增殖能力弱于正常MSC細(xì)胞，經(jīng)過VEGF處理后，AA患者M(jìn)SC增殖能力增強(qiáng)。

2.3 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC細(xì)胞周期情況比較見圖2。

圖2 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC細(xì)胞周期情況比較

由圖2可見，與正常MSC組相比，AA組MSC G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例增加，G2期無明顯變化，說明細(xì)胞阻滯在S期，增殖能力減弱。與AA組相比，AA+VEGF組MSC G1期細(xì)胞比例無明顯變化，S期細(xì)胞比例降低，G2期細(xì)胞比例增加，說明細(xì)胞進(jìn)入G2期，增殖能力增強(qiáng)。與AA+VEGF組相比，AA+DAPT+VEGF組MSC G1期細(xì)胞比例無明顯變化，S期細(xì)胞比例增加，G2期細(xì)胞比例降低，說明細(xì)胞阻滯在S期，增殖能力減弱。即AA患者M(jìn)SC細(xì)胞增殖能力弱于正常MSC細(xì)胞，VEGF通過阻斷S期細(xì)胞促進(jìn)AA患者M(jìn)SC的增殖，抑制其凋亡。

2.4 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC VEGF蛋白與Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較見圖3。

圖 3 正常 MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC VEGF蛋白與Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

由圖3可見，與正常MSC組相比，AA組MSC VEGF、VEGFR、Cleaved Notch-1、Notch-1、Jagged1、Deltalike1、hes1蛋白表達(dá)均下調(diào)。與AA組相比，AA+VEGF組 MSC VEGF、VEGFR、Cleaved Notch-1、Notch-1、Jagged1、Delta-like1、hes1蛋白表達(dá)均上調(diào)。與AA+DAPT組比較，AA+DAPT+VEGF組 MSC Cleaved Notch-1、Notch-1、Jagged1、Delta-like1、hes1 蛋白表達(dá)上調(diào)，但低于AA+VEGF組。

2.5 AA組與正常MSC組MSC VEGF與Notch信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況比較見圖4。

圖4 AA組與正常MSC組MSC VEGF與Notch信號通路相關(guān)基因 mRNA 表達(dá)情況比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖4可見，與正常MSC組相比，AA組MSC VEGF、VEGFR、Notch-1、Jagged1、Delta-like1、hes1 基因 mRNA表達(dá)均下調(diào)。即AA患者的MSC Notch信號通路與VEGF表達(dá)受抑制。

2.6 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組MSC內(nèi)皮分化能力比較見圖5。

圖5 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組MSC內(nèi)皮分化程度比較（免疫熒光染色，×200）

由圖5可見，與正常MSC組相比，AA組MSC CD31陽性細(xì)胞比例明顯降低，說明內(nèi)皮分化程度降低。與AA組相比，AA+DAPT組MSC CD31陽性細(xì)胞比例降低，說明內(nèi)皮分化程度降低。即AA患者M(jìn)SC內(nèi)皮分化能力弱于正常MSC，DAPT可進(jìn)一步抑制MSC內(nèi)皮分化。

3 討論

AA是血液系統(tǒng)常見疾病，有研究認(rèn)為其與造血干細(xì)胞內(nèi)在增殖或分化缺陷，骨髓造血微環(huán)境異常及機(jī)體免疫功能紊亂有關(guān)，3種機(jī)制在不同個體單獨(dú)或聯(lián)合作用，導(dǎo)致造血功能衰竭[1]。目前認(rèn)為，AA是一種以造血系統(tǒng)為靶目標(biāo)的自身免疫性疾病。造血干細(xì)胞無細(xì)胞及分子遺傳學(xué)異常，因此骨髓衰竭的始動因素應(yīng)該來源于造血微環(huán)境而非造血干細(xì)胞。研究表明，MSC作為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，是一類具有自我更新能力和免疫調(diào)節(jié)作用的干細(xì)胞，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，其通過介導(dǎo)造血干細(xì)胞黏附，分泌多種細(xì)胞因子和生長因子而發(fā)揮造血支持作用[2-4]。AA患者M(jìn)SC的異?？赡茉谄浒l(fā)病機(jī)制中產(chǎn)生重要作用[5-7]。

臨床上發(fā)現(xiàn)，AA患者血清VEGF水平明顯低于正常人。其降低的機(jī)制可能是患者的骨髓造血功能障礙，骨髓血管減少，血管通透性降低，供血、供氧量減少，VEGF分泌減少，進(jìn)一步地加速了骨髓的脂肪化。AA患者血清VEGF水平的降低可能成為導(dǎo)致干細(xì)胞集落形成能力降低以及骨髓微環(huán)境支持功能缺陷的因素之一。有研究報(bào)道，AA患者的VEGF表達(dá)低于正常對照組，VEGF對大鼠MSC有明確的促增殖作用，其作用機(jī)制與Notch信號通路密切相關(guān)[8]。Notch信號通路對血管的發(fā)育和形成起重要的調(diào)控作用，其間涉及到Notch信號通路與MSC間復(fù)雜的關(guān)系，但具體的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明[9]。

Notch信號通路是一個在進(jìn)化上高度保守的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，廣泛存在于所有已知動物細(xì)胞中，調(diào)控著幾乎所有的組織和器官細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。鑒于Notch信號通路在調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的功能中起到的重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，多種血液惡性疾病的Notch信號通路存在異常，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[10]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路導(dǎo)致AA的發(fā)生，可能與從TBX21下調(diào)Notch-1有關(guān)[11]。Notch信號通道參與MSC向軟骨細(xì)胞分化的過程，對于單層培養(yǎng)MSC，γ-分泌酶抑制劑DAPT可抑制Notch信號通道，不僅可抑制MSC的增殖，亦可抑制MSC成軟骨分化[12]。Notch被認(rèn)為是AA發(fā)病機(jī)制的主要驅(qū)動因子。據(jù)報(bào)道，Notch信號通路參與調(diào)節(jié)AA小鼠模型中的Treg/Th17平衡[13]。

本研究結(jié)果顯示，AA患者M(jìn)SC的Notch信號通路受抑制，MSC內(nèi)皮分化能力弱于正常MSC細(xì)胞，而VEGF通過激活Notch信號通路可促進(jìn)AA患者M(jìn)SC的增殖。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF可通過阻斷S期細(xì)胞促進(jìn)AA患者M(jìn)SC的增殖，抑制其凋亡。VEGF的干預(yù)可以恢復(fù)AA患者的增殖能力。這說明，VEGF可通過Notch信號通路調(diào)控AA患者M(jìn)SC，從而改善骨髓造血微環(huán)境，并與患者造血功能恢復(fù)有關(guān)。同時本研究結(jié)果驗(yàn)證了AA患者存在骨髓造血微環(huán)境異常，這為再障免疫學(xué)提供新的理論參考。