微生物代謝組學(xué)及其在白酒釀造中的應(yīng)用研究進(jìn)展

王珂佳，邱樹毅*

（1.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 輕工化工系，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分誕生于20世紀(jì)90年代初，是一門繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后迅速發(fā)展起來的新興學(xué)科，它以生物體或細(xì)胞中所有相對分子質(zhì)量1 000以下的小分子代謝產(chǎn)物作為研究對象，利用高通量、高靈敏度、高分辨率的現(xiàn)代儀器分析技術(shù)，結(jié)合模式識別等化學(xué)計量學(xué)方法進(jìn)行定性和定量分析，揭示生物體或細(xì)胞相關(guān)代謝途徑及其變化規(guī)律[1]。

微生物是自然界中分布最廣、種類最多的物種。由于微生物系統(tǒng)相對簡單，基因數(shù)據(jù)豐富以及對微生物生理特征了解全面，代謝組學(xué)在微生物領(lǐng)域被越來越廣泛的應(yīng)用。微生物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)的重要研究領(lǐng)域，它主要是通過代謝圖譜對微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量、定性分析，研究代謝機(jī)制，監(jiān)測和優(yōu)化發(fā)酵工藝。1992年，ELMROTH I等[2]首次利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS），結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法檢測了脂肪酸、氨基酸和糖類物質(zhì)含量，以評估腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）在培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染情況，微生物代謝組學(xué)隨之應(yīng)運而生。目前，微生物代謝組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于不同的研究領(lǐng)域[3]。近年來，利用代謝組學(xué)技術(shù)對微生物多樣性，誘變育種，功能基因，代謝途徑及其代謝產(chǎn)物功能進(jìn)行研究成為了熱門方向。

中國白酒歷史悠久，經(jīng)過六千多年的演化，形成了以大曲、小曲或大小曲聯(lián)用作為糖化發(fā)酵劑的固態(tài)發(fā)酵工藝[4]。該工藝是一個復(fù)雜的微生物混合協(xié)同作用過程，尤其在制曲和發(fā)酵環(huán)節(jié)，大曲、小曲等糖化發(fā)酵劑中的微生物利用自身酶系代謝和與原料作用代謝所產(chǎn)生的香氣物質(zhì)進(jìn)入白酒中，形成復(fù)雜而協(xié)調(diào)的酒體風(fēng)味。近年來，微生物代謝組學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于白酒釀造中微生物菌落結(jié)構(gòu)分析、產(chǎn)酶及代謝途徑研究[5-7]。在白酒生產(chǎn)過程中，通過對釀酒微生物細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)的分析來揭示風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)制，實現(xiàn)發(fā)酵過程的動態(tài)監(jiān)測，并據(jù)此優(yōu)化發(fā)酵條件，改善酒體風(fēng)味質(zhì)量。本文圍繞微生物代謝組學(xué)的研究內(nèi)容、研究過程及其在白酒風(fēng)味物質(zhì)定性、定量研究和釀造工藝優(yōu)化方面的研究進(jìn)行了概述，分析了微生物代謝組學(xué)在白酒釀造應(yīng)用研究中的優(yōu)勢和不足，為今后更好的利用微生物代謝組學(xué)解析白酒風(fēng)味形成、發(fā)掘微生物多樣性資源和優(yōu)化生產(chǎn)工藝奠定基礎(chǔ)。

1 微生物代謝組學(xué)的研究內(nèi)容

1.1 微生物分類鑒定

目前，常用的微生物分類方法有表型分類法和基因型分類法。表型分類法是根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)、生理生化學(xué)、生態(tài)學(xué)等的相似程度分群歸類；基因型分類法是指利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如16S rDNA測序，DNA雜交以及聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）指紋圖譜等對微生物系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性進(jìn)行分類[8]。一般情況下，細(xì)胞在基因水平上存在細(xì)微差異都會在最終代謝產(chǎn)物上被體現(xiàn)出來，產(chǎn)生明顯不同的代謝表型，因此新興的代謝物圖譜分析技術(shù)成為一種全面、快速、高通量的微生物分類鑒定方法。ADNANI N等[9]利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法對海洋微生物的代謝物進(jìn)行分析并鑒定出12個小單孢菌科。TRIEST D等[10]利用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chro matography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS-MS）方法在臨床上鑒定真菌和其他微生物。CHENG C等[11]利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)對46株從12種不同的海洋海綿物種中分離出的放線菌進(jìn)行代謝組學(xué)分析鑒定，顯示其分別為鏈霉菌（Streptomyces）SBT348和小單孢菌（Micromonospora）SBT687。SOGA T等[12]利用毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS）系統(tǒng)研究了芽孢發(fā)生時枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的代謝譜變化情況，識別出代謝物1692種，并鑒別出其中的150種。熊萍等[13]采用核磁共振氫譜（1H-nuclearmagnetic resonance，1H-NMR）代謝組學(xué)方法對變異鏈球菌（Streptococcus mutans）、血鏈球菌（Streptococcus sanguis）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的代謝物譜進(jìn)行分析，成功檢測了不同菌株細(xì)胞外代謝物的差別。SAMELISJ等[14]采用傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析方法（Fouriertransform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）獲得了傳統(tǒng)希臘Graviera奶酪中乳酸菌（Lactobacillus）胞外代謝物的紅外光譜圖，通過與數(shù)據(jù)庫比較實現(xiàn)了乳酸菌的鑒定。DUSKOVA M等[15]通過比較基因型技術(shù)PCR、擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析（16S-amplified ribosomal DNA restriction analysis，16S-ARDRA）以及代謝物圖譜分析技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDITOF-MS）對乳酸菌的鑒定能力，證明在種的水平上MALDITOF-MS更具有優(yōu)勢，且準(zhǔn)確率達(dá)到93%。除了分類鑒定外，利用代謝物譜分析技術(shù)還可以進(jìn)行突變體的篩選，曹晶晶[16]利用代謝圖譜分析出擬南芥野生型與其突變體opr3存在明顯的代謝物差異。柴振光[17]利用代謝物譜分析技術(shù)構(gòu)建了鹽芥激活標(biāo)簽突變體庫和篩選出鹽芥轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽的突變體。代謝組學(xué)在微生物分類鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用彌補(bǔ)了傳統(tǒng)微生物分類鑒定手段的不足，正被更廣泛地應(yīng)用于愈加深入的研究中。

1.2 代謝物分析與鑒定

代謝物分析和鑒定是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵內(nèi)容。質(zhì)譜分析技術(shù)因其具有高靈敏度和高特異性，被廣泛應(yīng)用于代謝產(chǎn)物分析和鑒定。TAN K C等[18]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)缺少Sch1基因的穎枯殼針孢（Septoria nodorum）突變菌株的次生代謝產(chǎn)物濃度是野生菌株的200倍，并鑒定該產(chǎn)物為交鏈孢酚。LOWE R G T等[19]采用GC-MS技術(shù)，非靶向分析了小麥病原菌孢子形成過程中相關(guān)代謝產(chǎn)物，證明殼聚糖在此過程中起著重要的作用。王越男等[20]采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）代謝組學(xué)技術(shù)研究了不同發(fā)酵方式生產(chǎn)的酸奶中益生菌的活性，結(jié)果表明采用單一益生菌發(fā)酵得到的產(chǎn)物和采用益生菌與傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑共同發(fā)酵得到的產(chǎn)物具有明顯的不同，同時，通過UPLC-QTOF-MS鑒定38個代謝物，分析出了兩種發(fā)酵方式得到的代謝產(chǎn)物的變化[21]。

1.3 發(fā)酵工藝研究

微生物通過發(fā)酵可以為人類提供諸如抗生素、酒類制品、功能食品及生物燃料等生活必需品。監(jiān)控和優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高目標(biāo)物產(chǎn)率和質(zhì)量一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。近年來，代謝組學(xué)分析方法被用于對代謝物進(jìn)行定性、定量分析，從而找到代謝途徑或代謝網(wǎng)絡(luò)中影響目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)生的關(guān)鍵反應(yīng)，并針對靶標(biāo)酶進(jìn)行遺傳改造，最終實現(xiàn)目標(biāo)物產(chǎn)率及質(zhì)量的提高。王向棟[22]以能夠轉(zhuǎn)化植物留醇生成9α-OH-AD的分枝桿菌（Mycobacterium）為研究對象，采用代謝工程的手段，對經(jīng)過改造甾醇代謝途徑中與目的產(chǎn)物合成相關(guān)的多個關(guān)鍵酶基因，而構(gòu)建的高效合成9α-OH-AD的基因工程菌株，進(jìn)行發(fā)酵過程工藝優(yōu)化，進(jìn)一步提高了目的產(chǎn)物9α-OH-AD的得率。陶瑞[23]構(gòu)建了植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的代謝組學(xué)分析方法，研究了植物乳桿菌及其3株亞油酸異構(gòu)酶系基因敲除株和植物乳桿菌的代謝特征，從極性小分子和脂肪酸這兩類代謝產(chǎn)物變化規(guī)律著手，進(jìn)一步闡明了其生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸差異的原因。邵明龍[24]以甾醇轉(zhuǎn)化過程關(guān)鍵酶為目標(biāo)，對新金色分枝桿菌（Mycobacterium aureus）轉(zhuǎn)化植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（androsterone-1,4-diene-3,17-diketone，ADD）過程中的關(guān)鍵酶：3-甾酮-Δ1-脫氫酶（3-sterone-Δ1-dehydrogenase，KSDD）、膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase，Cho M）、甾酮C27單加氧酶（sterone C27 monooxygenase，SMO）和3-甾酮-9α-羥化酶（3-gonone-9-alpha-hydroxylase，KSH）進(jìn)行研究，利用代謝工程策略，實現(xiàn)了ADD的高效積累。微生物代謝組學(xué)在發(fā)酵食品分析中的應(yīng)用為發(fā)酵機(jī)理的研究提供了更準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)支持，進(jìn)而為發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供明確的思路和方向。

2 微生物代謝組學(xué)的研究過程

微生物代謝組學(xué)的研究過程具有精確、靈敏、高通量等特點，通常包括樣品制備和預(yù)處理，代謝物的檢測、分析及鑒定和數(shù)據(jù)處理分析三個環(huán)節(jié)。

2.1 樣品制備和預(yù)處理

樣品制備和預(yù)處理是微生物代謝組學(xué)研究的初始步驟，包括快速取樣、淬滅以及代謝物的提取。

2.1.1 快速取樣

為防止底物濃度發(fā)生巨大變化，維持微生物代謝物穩(wěn)定，一般利用連續(xù)擾動（Bio Scope）裝置[25]和快速換膜過濾（fast Swinnex filtration，F(xiàn)SF）裝置[26]進(jìn)行樣品的快速采集。其中，Bio Scope裝置由連通發(fā)酵罐的透氧硅管組成，發(fā)酵液以恒定速度流過透氧硅管，管道中的塞子不斷運動，使發(fā)酵液與擾亂劑混合開始擾動，根據(jù)發(fā)酵進(jìn)程，在管道的不同位置對發(fā)酵液進(jìn)行取樣測定[27-28]；FSF裝置依靠注射器、空壓機(jī)等加壓設(shè)備，使用壓力驅(qū)動液體培養(yǎng)物通過Swinnex換膜過濾器進(jìn)行快速過濾采樣和樣品提取，該方法可廣泛應(yīng)用于厭氧液體培養(yǎng)系統(tǒng)[26]。

2.1.2淬滅

快速取樣后，需要快速淬滅酶活力，終止代謝反應(yīng)，保持細(xì)胞完整性，從而獲得特定時間內(nèi)樣品的真實信息。李泳榆等[29]應(yīng)用高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（high performance liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry，HPLC-MS/MS），分析不同濃度甲醇作為淬滅劑以及不同離心收獲條件對鼠傷寒沙門菌胞內(nèi)代謝物的泄漏影響及不同淬滅條件下DNA和蛋白質(zhì)的滲出濃度，利用光密度回收率評估細(xì)胞完整性，結(jié)果表明使用-40℃體積分?jǐn)?shù)為100%甲醇淬滅細(xì)胞并以3 000×g離心15 min收集菌體，胞內(nèi)代謝物得到最大保留。VILLAS-BOAS S G等[30]提出了用冷甲醇溶液對酵母細(xì)胞進(jìn)行淬火，然后用純甲醇萃取胞內(nèi)代謝物的方法。楊泓喆[31]采用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)60%甲醇/0.9%碳酸銨溶液淬滅、珠磨法破碎細(xì)胞和N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（N-methyl-N-（trimethylsilyl）trifluoroa-cetamide，MSTFA）衍生2 h，該方法從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中共鑒定到223種代謝物，包含了大量的氨基酸、有機(jī)酸和糖類物質(zhì)。王亮[32]在研究釀酒酵母高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵體系振蕩行為時，建立了以冷甲醇法和冷氯仿-甲醇-緩沖液法進(jìn)行釀酒酵母細(xì)胞代謝淬滅的方法。

2.1.3代謝物的提取

代謝物提取是微生物代謝組學(xué)研究中的重要步驟，在設(shè)計提取方法時應(yīng)遵循在盡量減少或避免代謝物發(fā)生物理或化學(xué)性質(zhì)變化的基礎(chǔ)上，提高提取回收率。常用的代謝物提取方法有冷甲醇、熱甲醇、高氯酸或堿、氯仿-甲醇混合液以及乙腈等。其中，冷甲醇法的適用性較好，對磷酸化糖、磷酸化有機(jī)酸和氨基酸類代謝物具有較好的提取效率；高氯酸提取法適用于核苷酸類物質(zhì)和水溶性代謝物提取；氯仿-甲醇法適用于非極性氨基酸、脂類等代謝物提取；乙腈法適用于極性代謝產(chǎn)物提取[33]。BERROU K等[34]基于攪拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）和頂空吸附萃取（headspace sorptive extraction，HSSE）的原理和對揮發(fā)性化合物更具特異性的優(yōu)點，在頂空條件下用乙二醇/硅氧烷（ethylene glycol/silicone，EGS）攪拌棒和細(xì)菌培養(yǎng)條件下用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）同時提取，發(fā)現(xiàn)提取的化合物數(shù)量明顯增加，為細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物提取提供了一種新的方法。戴詩皎等[35]在檢測濃香型白酒酒醅中總酯含量時，利用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇浸提酒醅樣品。張崇軍等[36]研究表明，利用體積分?jǐn)?shù)為55%的冷甲醇從大曲樣品中提取出黃曲霉毒素B1效率最好。徐延等[37]研究表明，提取醬香型大曲類黑素的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，提取溫度70℃，提取時間3 h，液固比17.5∶1（mL∶g）。然而，由于代謝物的多樣性，通常很難通過單一的一種提取方法提取全部胞內(nèi)代謝物，因此結(jié)合不同的方法有利于提高代謝物提取效果。

2.2 代謝物的檢測、分析及鑒定

微生物代謝組學(xué)對代謝物進(jìn)行檢測、分析及鑒定的主要技術(shù)有色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和核磁共振技術(shù)。

2.2.1 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有較高的靈敏度和專屬性，可以實現(xiàn)對多個化合物的同時快速分析與鑒定，是微生物代謝組學(xué)研究的常用方法之一。目前，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）因其兼?zhèn)渖V的高分離度、高通量及質(zhì)譜的普適性、高靈敏度和特異性，被廣泛運用到微生物代謝組學(xué)的研究中。陶瑞[23]通過利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）測定了植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的含量；白雪等[38]利用電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對乳品風(fēng)味成分進(jìn)行分析。隨著技術(shù)發(fā)展，在微生物代謝組學(xué)研究領(lǐng)域相繼出現(xiàn)了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（full two dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）、離子色譜-電噴霧質(zhì)譜（ion chromatography-electrospray mass spectrometry，IC-ES-MS）及毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）等技術(shù)。李俊等[39]采用頂空固相微萃?。╤eadspace-solidphase microextraction，HS-SPME）與全二維氣相飛行時間質(zhì)譜相結(jié)合的方法，建立了白酒中揮發(fā)性風(fēng)味成分分析方法，并對白酒中62種主要揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定性定量分析。

2.2.2 核磁共振技術(shù)

技術(shù)是目前微生物代謝組學(xué)研究的主要分析技術(shù)。能快速準(zhǔn)確無損傷的對代謝產(chǎn)物中大多數(shù)化合物進(jìn)行高通量分析并提供一定條件下的完整代謝圖譜。李兵[40]利用1H-NMR技術(shù)檢測白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌不同時段的代謝產(chǎn)物，繪制出了不同念珠菌（Candida）的特征性代謝核磁共振譜圖。張亞飛[41]建立了一種方便、快捷、無損的低場核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)對產(chǎn)鹽霉素菌株發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的大豆油含量進(jìn)行檢測。

2.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理方法

通過色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和核磁共振技術(shù)所獲得的原始數(shù)據(jù)可采用K近鄰法、連續(xù)K近鄰法或多重插補(bǔ)法進(jìn)行缺失值填補(bǔ)，應(yīng)用正態(tài)、極差、均值、中位數(shù)、中心化或總強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化等方法進(jìn)行預(yù)處理[42]，消除干擾因素后，利用主成分分析法（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘法（partial least squares，PLS）等進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和生物信息學(xué)分析，再通過ECMDB、YMDB、HMP和KEGG等微生物代謝組學(xué)研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫，有效進(jìn)行生物標(biāo)志物鑒定，從而揭示目標(biāo)代謝產(chǎn)物及代謝途徑[3]。

3 微生物代謝組學(xué)在白酒釀造中的應(yīng)用進(jìn)展

3.1 白酒風(fēng)味物質(zhì)定性、定量研究

中國白酒釀造是以高粱、大米等谷物為原料，采用大曲、小曲或麩曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)過一系列復(fù)雜的酶化學(xué)反應(yīng)、生化反應(yīng)、有機(jī)化學(xué)反應(yīng)及微生物代謝活動的過程。在此過程中，原料本身的香味物質(zhì)，酒曲中微生物代謝產(chǎn)物、酒醅蒸餾中產(chǎn)生的香氣物質(zhì)及窖泥微生物代謝產(chǎn)生的香氣物質(zhì)，共同形成了白酒的風(fēng)味物質(zhì)[43]。目前，已經(jīng)從中國白酒中檢測出風(fēng)味物質(zhì)成分達(dá)300種以上，包括醇類、酸類、酯類、氨基酸類、羥基化合物、縮醛、含氮化合物、含硫化合物、呋喃類化合物、酚類化合物、醚類等[44]。根據(jù)風(fēng)味物質(zhì)不同，中國白酒主要分為了醬香型、濃香型、清香型及兼香型等10種香型，應(yīng)該說風(fēng)味物質(zhì)直接決定了白酒的香型與質(zhì)量。近年來，廣大研究者利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、多維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（multi-dimensional gas chromatography-mass spectrometry，MD-GC-MS）及氣相色譜-聞香法（gas chromatography-olfac tometry，GC-O）等[45]微生物代謝組學(xué)研究手段對白酒中風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了定性、定量研究，為下一步研究其風(fēng)味形成機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。徐巖[45]利用氣相色譜-聞香法（GC-O）研究了醬香型、濃香型、清香型、鳳香型、藥香型及兼香型白酒中的風(fēng)味活性物質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，明確了濃香、清香、醬香等10種香型白酒的風(fēng)味特征及重要風(fēng)味物質(zhì)及其微生物代謝機(jī)制，對提升白酒風(fēng)味及其品質(zhì)具有重要意義。劉燕梅等[46]采用頂空-固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)發(fā)現(xiàn)從濃香型白酒窖泥中篩選出的3株細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物主要為高級醇、高級酮等芳香類化合物，具有放香、助香及調(diào)香的作用，促進(jìn)濃香型白酒風(fēng)味形成。路江浩等[47]采用在線直接實時分析（direct analysis in real-time，DART）離子源串聯(lián)四級桿質(zhì)譜技術(shù)，建立了一種在線檢測口腔中白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)釋放過程的方法，有效監(jiān)測白酒品嘗過程中典型風(fēng)味物質(zhì)釋放的時間-強(qiáng)度變化，為進(jìn)一步研究白酒品嘗中風(fēng)味物質(zhì)釋放規(guī)律和余味形成機(jī)制提供技術(shù)支撐。陳華明等[48]采用氣相色譜法對柔和醬香型和醬香型白酒中63種風(fēng)味組分進(jìn)行檢測，結(jié)合嗅閾值計算各樣品中風(fēng)味組分的香氣活性值（odor activity value，OAV），確定29種主要風(fēng)味組分進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)柔和醬香型白酒區(qū)別于醬香型白酒的特征成分主要集中在第2主成分中，包括糠醛、3-羥基-2-丁酮、丁酸乙酯、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、2-丁醇、正丙醇、丁酸以及己酸。周森等[49]采用固態(tài)發(fā)酵實驗對從牛欄山清香型大曲中分離釀酒酵母的可揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其風(fēng)味物質(zhì)共28種，主要為酸、醇、酯3大類。何培新等[50]采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜研究了濃香型白酒窖泥中厭氧梭菌屬（Anaerobic clostridium）細(xì)菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物主要為酯類、酸類、醇類和醛類，對窖泥中厭氧梭菌揮發(fā)性代謝物分析，有利于生物強(qiáng)化白酒風(fēng)味物質(zhì)和溯源及控制白酒異嗅物質(zhì)產(chǎn)生。黃月等[51]利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、測定了脫皮青稞黃酒、不脫皮青稞黃酒及青稞麩皮中揮發(fā)性和半揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)未脫皮青稞黃酒和脫皮青稞黃酒在揮發(fā)性香氣成分上的差異主要來源于麩皮中富含的苯丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸通過代謝所產(chǎn)生的苯乙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇，3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基丙醇，表明青稞麩皮對黃酒風(fēng)味的形成會生產(chǎn)積極影響。吳樹坤等[52]采用固相萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（SPME-GC-MS）對沉香型酒醅中分離產(chǎn)香芽孢桿菌并進(jìn)行了發(fā)酵風(fēng)味分析，共檢測到24種風(fēng)味物質(zhì)。綜上，微生物代謝組學(xué)技術(shù)在各個類型白酒及白酒釀造各個階段的風(fēng)味物質(zhì)鑒定方面的廣泛的應(yīng)用，為進(jìn)一步研究白酒風(fēng)味形成機(jī)制提供了基礎(chǔ)，為不同風(fēng)味白酒的釀造工藝優(yōu)化及定向生產(chǎn)提供了理論支撐。

3.2 白酒釀造工藝優(yōu)化

中國白酒獨特的釀造工藝有利于形成特定的微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)相關(guān)酶反應(yīng)、生化反應(yīng)及代謝活動發(fā)生，產(chǎn)生特有的風(fēng)味，可以說“工藝”決定了“風(fēng)味”。因此，為了改善白酒風(fēng)味，提升品質(zhì)，近年來，微生物代謝組學(xué)技術(shù)被大量應(yīng)用于優(yōu)化釀造工藝領(lǐng)域。鄧劍清[53]利用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測強(qiáng)化高溫大曲和普通高溫大曲香氣化合物組成，比較分析出兩者共有的香氣化合物有21種，其中強(qiáng)化高溫大曲中醬香型白酒的香氣成分的吡嗪類物質(zhì)、苯甲醛、苯乙醇明顯髙于普通高溫大曲。將強(qiáng)化高溫大曲應(yīng)用于生產(chǎn)醬香型白酒，有利于醬香型白酒的品質(zhì)提高。李莉莉[54]通過微生物代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合表型分析對16株釀酒酵母在不同脅迫下的應(yīng)激機(jī)制進(jìn)行了研究，探討了釀酒酵母耐性與發(fā)酵性能之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高溫耐性和山梨醇耐性都會顯著影響釀酒酵母的乙醇的生產(chǎn)能力，為利用釀酒酵母耐性的調(diào)控機(jī)制優(yōu)化發(fā)酵工藝條件提供了理論依據(jù)。

4 展望

代謝組學(xué)作為一門新興學(xué)科已被廣泛地用于微生物代謝產(chǎn)物、發(fā)酵途徑機(jī)制及發(fā)酵工藝監(jiān)控優(yōu)化等研究領(lǐng)域。目前，微生物代謝組學(xué)已成為了代謝組學(xué)的一個重要分支學(xué)科，但其在發(fā)展上存在以下幾個方面的問題：①由于微生物培養(yǎng)條件的限制，導(dǎo)致了部分分析檢測技術(shù)在使用上有局限；②微生物代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫建設(shè)還不完善；③微生物代謝組學(xué)更多關(guān)注的是對代謝產(chǎn)物定性、定量研究，在相關(guān)代謝途徑及機(jī)制研究上深入不夠，特別在白酒釀造領(lǐng)域，目前主要集中在風(fēng)味成分定性、定量研究方面，但對風(fēng)味成分產(chǎn)生途徑和機(jī)制研究還不夠深入。因此，對于白酒風(fēng)味物質(zhì)的研究，應(yīng)利用代謝組學(xué)原理探究釀造工藝的微生物代謝途徑及機(jī)制，剖析其微生態(tài)作用過程，找到相關(guān)功能菌株，運用基因工程技術(shù)對功能菌株行改良和選育以獲得強(qiáng)化菌株，將其運用于釀酒生產(chǎn)中，從而提高白酒品質(zhì)、原料利用率和出酒率，實現(xiàn)“節(jié)能降耗、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)”的效果。同時，由此積累的經(jīng)驗和方法也將助推微生物代謝組學(xué)的發(fā)展。