滅活乳酸菌研究與應用前沿進展

■張宏福 夏 冰 陳 亮 鐘儒清 王云龍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.山東保安康生物技術有限公司，山東臨沂 273300）

益生菌（Probiotics）是一類定植于宿主腸道、生殖系統(tǒng)，并對宿主產(chǎn)生有益功效的活性微生物總稱[1]。益生菌主要分為三類：乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌。乳酸菌是一類以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的革蘭氏陽性菌[2]，主要包括乳酸桿菌、乳球菌、鏈球菌和雙歧桿菌等菌屬[3]。乳酸菌在抵御致病菌、增強免疫力、促進腸道生態(tài)平衡及維護腸道健康方面發(fā)揮重要作用，已經(jīng)被廣泛應用于食品、生物工程及生命健康等領域[4-6]。然而，大量使用活菌引起的安全問題如細菌感染、抗生素耐藥基因的產(chǎn)生及超敏反應等已經(jīng)逐漸引起人們的關注[7]。相較于活菌，滅活乳酸菌安全性更高，且具有多種相同的生理功能，只是兩者發(fā)揮作用的機理有所不同。滅活乳酸菌具有吸附毒素、黏附頡頏致病菌、增強免疫力及使用便捷等優(yōu)勢，在動物生產(chǎn)中具有較大的應用潛力。然而，目前滅活乳酸菌在我國畜牧行業(yè)中應用仍然較少，主要是對其生理作用及機制尚不清晰，以及尚不明確在飼糧中的適宜添加量。因此，本文旨在綜述滅活乳酸菌的生理功能及其作用機制，并綜述其在國內(nèi)外畜禽生產(chǎn)中的應用效果，從而為滅活乳酸菌的進一步開發(fā)和利用提供理論指導。

乳酸菌滅活主要分為物理和化學兩種方式。物理方式包括：熱滅活、高壓滅活、紫外照射、γ-射線照射、反復凍融及超聲波滅活；化學方式包括：甲醛、乙醇、酸或堿滅活。其中，熱滅活方式是目前應用最為廣泛的一種[8-9]。

1 滅活乳酸菌的優(yōu)勢

1.1 安全性高

益生菌活菌的安全性問題已經(jīng)引起人們的關注，Wagner等[10]研究報道，活菌的基因突變、非正常部位轉(zhuǎn)移以及耐藥性基因的產(chǎn)生都可能增加菌體致病的風險，特別是針對免疫力低下或免疫缺陷的病人，服用益生菌活菌制劑極易出現(xiàn)病理反應。在免疫缺陷小鼠體內(nèi)定植乳桿菌、雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)定植了乳桿菌的小鼠出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，同樣患有免疫缺陷的成年小鼠也出現(xiàn)了死亡[10]。對比之下，乳酸菌滅活之后不會在宿主體內(nèi)生長繁殖，具有更高的安全性。

1.2 穩(wěn)定性高

乳酸菌活菌對保存和運輸條件以及保質(zhì)期有嚴格的要求，目前市場上大部分活菌益生菌均需在低溫（4℃）下運輸和保存，保質(zhì)期也僅為幾天至十幾天。另一方面其進入消化道內(nèi)，很容易受到胃酸、膽汁及消化酶等的影響，不能到達腸道發(fā)揮作用[11]。相比較而言，滅活乳酸菌不受環(huán)境溫度影響，具有耐高溫的特性，能順利進入宿主腸道并黏附于腸道上皮，競爭排斥致病微生物，從而保護腸道[9]。

1.3 便捷性

在使用過程中，滅活乳酸菌制劑對菌的數(shù)量沒有限制。而活菌制劑通常須達到一定數(shù)量的活菌數(shù)才可發(fā)揮療效。有研究指出使用益生菌活菌時，要獲得預期的結(jié)果，食品中活菌最低添加數(shù)量在106CFU/g或最低平均日攝入量為108CFU/g，以補償活菌在通過胃腸道過程中的消耗，能夠提供足夠活細胞定植于宿主腸道[11]。然而若過量添加又可能引起一些不良反應，因此益生菌活菌制劑使用量較難控制。此外，滅活乳酸菌也可直接加入動物飲水中，使用便捷。

1.4 協(xié)同作用

活菌制劑不能和抗生素聯(lián)用，抗生素在殺死致病菌的同時也會殺滅益生菌活菌，導致宿主正常菌群失調(diào)，引發(fā)一系列不良反應。滅活乳酸菌可與抗生素、丁酸鹽及其他活菌制劑等合用，不會出現(xiàn)敏感反應[12]。

2 滅活乳酸菌的生理功能及作用機制

2.1 吸附毒素和黏附頡頏作用（見圖1）

圖1 滅活乳酸菌的主要生理功能

滅活乳酸菌在吸附霉菌毒素、抑制病原微生物及改善腸道健康等方面均具有有效性，這與其黏附頡頏作用有關。在吸附霉菌毒素方面，Pierides等[13]選取幾株乳酸菌用來研究其對黃曲霉毒素的吸附作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是活菌還是熱滅活乳酸菌都能減少PBS液中黃曲霉毒素的含量，其中兩株鼠李糖乳桿菌（LBGG和LC-705）表現(xiàn)出極強的吸附能力，進一步研究其在全脂和脫脂牛奶中的吸附作用，發(fā)現(xiàn)與活菌相比，熱滅活LBGG吸附能力更強、結(jié)合更穩(wěn)定。Hatab等[14]也發(fā)現(xiàn)熱滅活乳酸菌可同樣有效地去除蘋果汁中的展青霉素。一方面，乳酸菌與霉菌毒素的結(jié)合機制是細胞壁肽聚糖與毒素之間的非共價鍵，滅活處理破壞了乳酸菌細胞壁的完整性，肽聚糖的交聯(lián)被打破，孔徑增加，因此毒素除了與細胞壁結(jié)合之外，還可與細胞壁內(nèi)的原生質(zhì)膜結(jié)合，從而增加滅活乳酸菌對毒素的吸附能力[15-16]。另一方面，也有研究提出，滅活乳酸菌細胞壁組分肽聚糖的物理結(jié)構及鄰位羥基和羧基并非吸附毒素的主要作用因素，而堿性氨基酸、硫醇和酯類化合物在吸附過程中發(fā)揮重要作用。并且，氫氧化鈉和酯化預處理乳酸菌可以顯著提高其吸附能力[17]。

黏附通常是病原菌入侵宿主的第一步，而益生菌也可通過黏附素與腸道黏膜上皮受體結(jié)合，通過競爭性黏附以阻止病原菌的定植，從而起到占位保護作用[18]。Hirano等[19]研究表明，植物乳桿菌在腦心浸出液培養(yǎng)基中能顯著抑制鼠傷寒沙門氏菌的生長，進一步通過細胞試驗發(fā)現(xiàn)其能夠通過空間占位作用，與沙門氏菌競爭共同黏附位點，從而減少致病菌對HT-29細胞的黏附。有研究表明，將沙門氏菌感染口服滅活乳酸菌的小鼠，6 d后經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，肝臟和脾臟中病原菌數(shù)量顯著降低，表明滅活乳酸菌在體內(nèi)也能抑制致病菌的黏附和增殖[20]。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，胃中幽門螺旋桿菌的形態(tài)在滅活乳酸菌的作用下由螺旋狀變?yōu)閺澢鸂詈颓驙?，表明滅活乳酸菌可通過改變致病菌正常結(jié)構和形態(tài)抑制其在宿主體內(nèi)的增殖和定植[21]。正常情況下，腸道菌群棲息于結(jié)腸的外黏液層，緊貼腸道上皮的內(nèi)黏液層幾乎無細菌存在，僅有特定類型的細菌（如變形菌門）能穿過內(nèi)黏液層與上皮細胞結(jié)合[7]。因此與活菌相比，滅活破壞了乳酸菌細胞壁完整性，細胞壁成分如脂磷壁酸和胞外多糖等釋放出來，有效地穿過黏液層到達腸道上皮，增強腸道黏膜的完整性。同時也促進細菌素和乳酸菌等抗菌物質(zhì)的分泌，表現(xiàn)出較強的頡頏特性[22-23]。

2.2 調(diào)控腸道黏膜屏障功能（見圖1）

正如上文所述，由于黏液層的保護作用，益生菌活菌很難接近腸道上皮細胞調(diào)控免疫反應。而滅活乳酸菌及其代謝產(chǎn)物能直接穿過黏液接觸腸道上皮，刺激免疫細胞的分泌能力。過度肥胖的人連續(xù)12周攝入熱滅活植物乳桿菌后免疫力增強，血清中膽固醇水平下降[24]。滅活益生菌及其菌體成分的靶標主要是巨噬細胞和B淋巴細胞。滅活乳酸菌能激活巨噬細胞并促進其分泌多種具有殺死腫瘤功能的細胞因子（如TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12等），增強機體非特異性免疫能力[25-26]。乳酸菌的組分主要是通過識別并結(jié)合模式識別受體如NOD樣受體和TLR家族以調(diào)控細胞因子的產(chǎn)生[27]。TLR2識別革蘭氏陽性菌上特定相關分子模式，募集信號后使下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB從IκB/NF-κB復合物中釋放，轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)促進相關炎性因子的產(chǎn)生[28]。TNF-α誘導Caco2細胞內(nèi)NF-κB入核、抑制胞漿中IκB的表達而引發(fā)炎癥反應，研究發(fā)現(xiàn)熱滅活乳酸菌可通過影響NF-κB/IκB信號通路降低促炎細胞因子IL-8的產(chǎn)生，進而發(fā)揮抗炎特性[29]。Rocha-RAMíREZ等[25]利用TLR2抗體和激動劑Pam3CSK4分別作用于巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)熱滅活乳酸菌依賴于TLR2信號途徑刺激巨噬細胞的分泌和吞噬能力，發(fā)揮免疫調(diào)控作用。IL-6是一種多效細胞因子，主要由單核巨噬細胞及Th2細胞產(chǎn)生，在誘導炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)和癌癥發(fā)生發(fā)展方面具有重要作用[30]。STAT蛋白家族在調(diào)節(jié)細胞因子依賴性炎癥和免疫方面發(fā)揮關鍵作用，其中STAT3因參與多種促炎細胞因子和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路而備受關注，STAT3的過度激活可通過腫瘤自主機制直接促進腫瘤生長，也可通過調(diào)節(jié)腫瘤相關間質(zhì)和免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應間接促進腫瘤生長[30]，炎癥刺激下過度釋放的IL-6可活化JAK1，促使STAT3的磷酸化和轉(zhuǎn)錄激活。而腫瘤細胞中STAT3的過度激活也會誘導IL-6的產(chǎn)生。DSS誘導的結(jié)腸炎小鼠IL-6、STAT3和p-STAT3表達量增高，而經(jīng)熱滅活乳酸菌后其表達量顯著降低，表明滅活乳酸菌能通過抑制IL-6/STAT3信號通路緩解DSS誘導的小鼠結(jié)腸炎[31]。

在結(jié)構上，腸道黏膜屏障由具備一定厚度的細胞外黏液層和腸道上皮細胞組成，在抵御微生物和外源性抗原方面起著重要作用。熱滅活乳酸菌能夠通過改善炎癥小鼠腸道組織形態(tài)緩解腸道損傷。緊密連接是一類具有黏附性的多蛋白復合物，通過封閉細胞間隙來調(diào)節(jié)屏障的通透性，是決定腸道跨上皮轉(zhuǎn)運速度和黏膜通透性的主要因素[32]。多項研究表明，滅活乳酸菌能通過增加炎癥模型小鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1和Claudin1等的表達量來提高腸道屏障功能的完整性，以緩解腸道損傷[33-34]。腸道杯狀細胞分泌的黏蛋白與水、無機鹽等形成了腸黏膜表面的黏液層，其與腸道上皮細胞、腸道微生物和免疫系統(tǒng)相互作用，共同維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[35-36]。Wang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，熱滅活乳酸菌能夠顯著上調(diào)小鼠十二指腸、回腸和結(jié)腸中MUC2的表達量，同時增加了糞便中黏蛋白的含量，經(jīng)PAS染色發(fā)現(xiàn)熱滅活乳酸菌通過增加杯狀細胞的數(shù)量和體積以促進黏蛋白的表達和分泌。其作用機制是滅活乳酸菌細胞壁成分脂磷壁酸與TLR2結(jié)合后激活下游p38-MAPK信號通路促進黏液分泌，同時抑制NF-κB及促炎細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α等的表達以緩解炎癥反應，最終改善宿主腸道健康[37]。

2.3 維持腸道菌群平衡

健康狀態(tài)下，腸道菌群維持在一個動態(tài)平衡狀態(tài)，各種菌豐度在一定范圍內(nèi)維持相對穩(wěn)定，然而受到外界刺激后，這種穩(wěn)定的平衡關系被打破，便可能導致腸道菌群失調(diào)。腸道菌群對宿主生理功能的影響主要體現(xiàn)在宿主代謝、免疫系統(tǒng)及黏膜屏障功能方面[38]。王然等[39]在便秘患者中測試普通常溫酸奶和滅活型副干酪乳桿菌潤腸通便的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)滅活副干酪乳桿菌能夠顯著增加受試者糞便中產(chǎn)短鏈脂肪酸（short chain fatty acid,SCFA）的菌屬如Blautia、Ruminococcus_2和Eubacterium_hallii_group等的豐度，同時糞便中丙酸、丁酸和總SCFA的含量，受試者排便次數(shù)也顯著增加，表明滅活乳酸菌通過調(diào)整腸道菌群及其代謝產(chǎn)物實現(xiàn)潤腸通便的作用。Wang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，滅活乳酸菌能通過增加黏液利用菌Akkermansia muciniphila的豐度促進黏蛋白的表達和分泌，進一步通過糞菌移植研究發(fā)現(xiàn)接受了來自飼喂滅活乳酸菌小鼠糞便的個體腸道中黏蛋白的表達和分泌顯著增加，表明滅活乳酸菌通過調(diào)控微生物增強黏液屏障的功能。

腸-肝生理軸是指腸道和肝臟之間密切的解剖學和功能關系。該機制通過血液循環(huán)將腸道中營養(yǎng)物質(zhì)和腸道抗原等通過門靜脈運輸至肝臟，肝臟又提供給腸道膽汁、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成分[40]。一旦腸道受損便使肝臟直接暴露于腸源性內(nèi)毒素環(huán)境中，反之，肝臟生理學遭到破壞也可能導致腸道功能障礙。該過程受飲食、遺傳和環(huán)境因子等多種因素共同影響[41]。研究發(fā)現(xiàn)熱滅活嗜熱乳酸鏈球菌降低糖尿病大鼠空腹血糖和總膽固醇水平，同時緩解葡萄糖不耐受癥狀，進一步研究發(fā)現(xiàn)該作用與熱滅活乳酸菌增強腸道黏膜屏障功能及提高有益菌（如Ruminococcaceae、Veillonella、Coprococcus和Bamesiella）相對豐度有關[42]。此外，滅活乳酸菌還能減少肥胖模型鼠肝臟中脂肪沉積，顯著降低小鼠的體重[37]。腸-腦生理軸是聯(lián)系消化道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的通路，具有雙向調(diào)節(jié)作用[43]。腸道菌群分泌的信號分子可通過腸-腦生理軸影響大腦認知和行為功能。研究發(fā)現(xiàn)口服滅活乳酸菌的小鼠結(jié)腸中五羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）的表達增加，和結(jié)腸內(nèi)容物中5-HT也顯著增加[44]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，5-HT作為一種廣泛存在的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與情緒、食欲、睡眠等神經(jīng)活動的調(diào)節(jié)，與情感性精神障礙、焦慮癥、精神分裂癥及孤獨癥的發(fā)生都有一定的關系[45]。Wang等[37]將熱滅活乳酸菌加入老齡肥胖小鼠的飲水中，研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，熱滅活乳酸菌組腸道菌群的多樣性、豐富度及組成均改變，通過行為測試發(fā)現(xiàn)小鼠的焦慮樣行為降低及記憶力增加。Warda等[46]也發(fā)現(xiàn)滅活乳酸菌能降低小鼠基質(zhì)皮質(zhì)酮的水平。皮質(zhì)酮是由腎上腺皮質(zhì)分泌的糖皮質(zhì)激素，皮質(zhì)酮的過量產(chǎn)生會引起抑郁樣行為的增加[47]。此外還發(fā)現(xiàn)盡管滅活乳酸菌對小鼠糞便微生物整體影響微弱，但與社會行為相關的菌屬發(fā)生顯著變化，從而改善了小鼠的行為能力[46]。除此之外，腸-腦生理軸還能通過下丘腦協(xié)同腸道激素參與調(diào)節(jié)動物食欲。胃促生長素又叫胃饑餓素，是由胃內(nèi)的腸內(nèi)分泌細胞產(chǎn)生，是已知唯一能夠刺激食欲的循環(huán)因子。滅活乳酸菌能通過促進?；复偕L素的分泌以及相關基因Syt3的表達，從而提高大鼠的食欲，增加其采食量[48]。

3 滅活乳酸菌在畜牧生產(chǎn)中的應用

3.1 在家禽生產(chǎn)中的應用

在家禽飼糧中添加滅活乳酸菌能促進家禽腸道吸收功能，提高免疫力，改善家禽生長性能。趙巍等[49]研究表明，在肉仔雞基礎飼糧中分別添加0.8%、1.6%、3.2%和6.4%的滅活植物乳桿菌培養(yǎng)物，6.4%的添加量可顯著增加肉仔雞平均日增重和料重比，1.6%的添加量可顯著增加肉仔雞平均日增重和盲腸中雙歧桿菌數(shù)量。這與王欣[50]的研究結(jié)果一致，其結(jié)果表明在肉仔雞飼糧中添加滅活植物乳桿菌菌液對肉仔雞的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率提高顯著，同時促進了肉雞的免疫功能。付麗[51]發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加滅活乳酸菌培養(yǎng)物能顯著提高免疫器官指數(shù)，增加血清中免疫球蛋白含量，提高生長性能，并發(fā)現(xiàn)在肉雞生產(chǎn)中使用一定量的滅活乳酸菌替代金霉素，可獲得更好的經(jīng)濟效益。Incharoen等[52]也發(fā)現(xiàn)，10 mg/kg熱滅活植物乳桿菌L-137能提高脾臟中細胞因子IL-12β、IFN-β和IFN-γ的表達，提高肉雞免疫能力，在替代抗生素類促生長物質(zhì)方面具有較大潛力。

小腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要部位，腸道穩(wěn)態(tài)是通過腸道干細胞的增殖分化實現(xiàn)的，腸道上皮細胞由隱窩向上遷移至絨毛，逐漸分化成熟并最終在絨毛頂端脫落[53]。Khonyoung等[54-55]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加熱滅活乳酸桿菌能夠促使腸道絨毛頂端突起細胞肥大，促進上皮細胞的增殖與更新，增加對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，從而提高肉雞生長性能。滅活乳酸菌還可與其他益生菌制劑配伍使用。Zhu等[56]在黃羽肉雞飼糧中添加熱滅活嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌復合物能夠增加Barnesiellaceae,Barnesiella和Lactobacillus aviaries的豐度，降低Lachnoclostridium和Peptococcus的豐度，調(diào)節(jié)腸道微生物的組成結(jié)構，維持腸道菌群的生態(tài)平衡，同時增加飼料轉(zhuǎn)化效率而降低血清中膽固醇和肌苷酸的含量，提高肉雞生長性能。目前，關于滅活乳酸菌與其他添加劑協(xié)同作用的研究較少，其適宜添加量和應用效果還需進一步研究。

3.2 在家畜生產(chǎn)中的應用

仔豬消化道發(fā)育不完善，對環(huán)境中致病菌抵抗力不足，斷奶時易發(fā)生腹瀉。在仔豬飼糧中添加滅活乳酸菌能夠提高豬的免疫抗病能力，降低仔豬腹瀉率。Kang等[57]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中分別添加0.1%、0.2%和0.4%的熱滅活乳酸菌均能降低血清中TNF-α、TGF-β和皮質(zhì)醇的濃度，提高仔豬的免疫力，從而降低仔豬腹瀉率。Arimori等[58]在仔豬飼糧中分別添加滅活乳酸菌和抗生素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均能提高仔豬生長性能，然而在先天免疫方面，與抗生素相比，滅活乳酸菌能顯著提高仔豬IFN-β的表達、中性粒細胞數(shù)量以及中性粒細胞與淋巴細胞的比例，這表明滅活乳酸菌在提高仔豬免疫能力方面可能優(yōu)于抗生素。IFN是一種高活性多功能的細胞因子，除具有調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)功能外，還具有抗病毒活性[59]。有研究表明，滅活植物乳桿菌能夠通過誘導小鼠血清中IFN-β的產(chǎn)生，降低小鼠肺部病毒效價，延長小鼠的存活時間[60]。盡管滅活乳酸菌抗病毒的機制尚不明確，但可為應對“非洲豬瘟”這一畜牧業(yè)難題提供一個重要思路。此外，滅活乳酸菌還能通過促使仔豬血清和糞便中免疫球蛋白A（IgA）的分泌提高免疫抗病能力[61]。TSUKAHARA等[62]研究了滅活乳酸菌的不同飼喂方式對仔豬生長性能的影響，發(fā)現(xiàn)無論是灌服（10 mg/kg）還是在飼糧中添加（0.05%）均能增加仔豬腸道空腸絨毛高度，提高其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，從而提高生長性能。

滅活乳酸菌作為哺乳犢牛的乳代替品，7 d后發(fā)現(xiàn)其血清葡萄糖和維生素A水平顯著增加，在第21 d時糞便中大腸桿菌數(shù)量顯著降低，而乳酸菌數(shù)量顯著增加，同時降低了整個周期內(nèi)犢牛的醫(yī)療次數(shù)[63]，這表明滅活乳酸菌能夠增強犢牛免疫機能，另外可促進有益菌群的定植及抑制有害菌的增殖，有利于犢牛的腸道健康。由于反芻動物特殊的消化器官，目前滅活乳酸菌在反芻動物中的研究仍然較少，還需著重探究滅活乳酸菌對反芻動物胃腸道健康的調(diào)控機理以及作為添加劑的應用價值。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，滅活乳酸菌具有黏附抗性、增強免疫能力和腸道黏膜屏障功能等多種生理功能。且滅活乳酸菌安全性高，不會造成細菌感染，尤其適用于畜禽幼齡階段。在畜禽飼糧中添加滅活乳酸菌能夠促進腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，提高機體免疫力和生長性能。目前，滅活乳酸菌在畜禽生產(chǎn)中的研究應用還相對缺乏，而限抗替抗已是全球畜牧業(yè)發(fā)展的必然趨勢，因此迫切需要進一步開發(fā)新型有益滅活乳酸菌，以飼料來源、腸道菌群和畜禽健康狀態(tài)為基礎進行綜合評估，精準的檢測使用方案是應用滅活乳酸菌維護畜禽健康的關鍵。