青菜頭中黑芥子苷的檢測(cè)方法及含量差異研究初報(bào)

王安良 唐璜 吳杰 鄭洋 鄭小玲

摘 ? 要 ? 以涪陵榨菜原料青菜頭為研究對(duì)象，取其葉、瘤狀莖及瘤狀莖的皮部和芯部，用高效液相色譜法測(cè)定青菜頭的黑芥子苷（2-丙烯基芥子苷）含量。用外標(biāo)法計(jì)算，測(cè)得青菜頭各部位的黑芥子苷含量為：葉2.78 g·kg-1 DW;瘤莖4.84 g·kg-1 DW;瘤莖表皮7.39 g·kg-1 DW;瘤莖里芯4.05 g·kg-1 DW。研究結(jié)果表明，青菜頭各部位的黑芥子苷含量：瘤莖表皮>瘤莖>瘤莖里芯>葉。

關(guān)鍵詞 ? 青菜頭;黑芥子苷;高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：S637 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.34.006

享譽(yù)海外的涪陵榨菜是重慶的一張?zhí)厣?，傳統(tǒng)涪陵榨菜采用風(fēng)脫水工藝[1]，屬于中國(guó)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)[2]。涪陵榨菜是以莖瘤芥的瘤芥（青菜頭）為原料經(jīng)整理、脫水、3次腌制而成的鹽腌菜，是一種半干態(tài)的具有輕微乳酸發(fā)酵的腌制品[3-4]。莖瘤芥屬十字花科[5]，含有豐富的芥子苷[6]，芥子苷是一類(lèi)具有抗癌防癌功能的物質(zhì)[7]。

芥子苷又稱硫代葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱硫苷）[8]，在十字花科蔬菜中屬于重要的次生代謝產(chǎn)物[9]，目前十字花科中發(fā)現(xiàn)芥子苷有20多種[10]，其結(jié)構(gòu)如圖1所示[11]。芥子苷通常由硫化肟基團(tuán)、β-D-硫葡萄糖基和來(lái)源于氨基酸的側(cè)鏈構(gòu)成。芥子苷有3個(gè)類(lèi)群，分別是吲哚族芥子苷、脂肪族芥子苷和芳香族芥子苷[12-13]。近年來(lái)，由于在抗癌、防癌方面的特殊功效，芥子苷研究成為流行病學(xué)、食品科學(xué)、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[14]。國(guó)際癌癥基金會(huì)指出，每天食用10 g左右富含芥子苷的蔬菜即可有效地預(yù)防癌癥的發(fā)生。除了具有抗癌功效外，芥子油苷水解產(chǎn)物對(duì)于植物抵抗細(xì)菌、真菌、病毒和蚜蟲(chóng)等都有重要作用。我國(guó)常見(jiàn)的十字花科蔬菜種類(lèi)包括白菜類(lèi)、甘藍(lán)類(lèi)、芥菜類(lèi)和蘿卜類(lèi)四大類(lèi)。存在于芥菜類(lèi)蔬菜中的芥子油苷有9種。黑芥子苷，又稱黑芥子硫苷酸鉀，也就是2-丙烯基芥子苷，為主要的芥子油苷種類(lèi)，屬于脂肪族芥子苷，它的R側(cè)鏈上連接的是一個(gè)2-丙烯基，其結(jié)構(gòu)如圖2所示[15]。黑芥子苷是中藥芥子的有效成分之一，有抗炎[16]、 通利內(nèi)臟、溫和開(kāi)胃、發(fā)汗散寒、化痰利氣、增進(jìn)食欲、促進(jìn)消化等功效[17]。

青菜頭為涪陵榨菜原料，屬于涪陵的特色產(chǎn)品，是十分重要的地方特殊經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)拉動(dòng)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)、帶領(lǐng)農(nóng)戶脫貧增收有著重要的作用。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)于芥子油苷的研究，主要集中于蘿卜、甘藍(lán)、花椰菜、芥菜、瑪咖等農(nóng)產(chǎn)品，而針對(duì)青菜頭中芥子油苷還鮮有研究。本文以青菜頭為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法測(cè)定青菜頭的黑芥子苷含量，并比較黑芥子苷含量在各器官間的差異，以期填補(bǔ)針對(duì)涪陵榨菜相關(guān)產(chǎn)品中芥子油苷的檢測(cè)方法空白，促進(jìn)涪陵榨菜特色產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇，色譜純，TEDLA公司;氯化鉀，分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司;乙酸鉛，分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司;超純水，由MERCK MilliPORE制得;黑芥子苷標(biāo)品，CAS號(hào)3952-98-5，純度≥98%，上海源葉生物有限公司;青菜頭，采自重慶市涪陵區(qū)致韓鎮(zhèn)菜地。

安捷倫1290高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器）、色譜柱：Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），Agilent Technologies;H23474組織破碎機(jī)，北京恒奧德儀器儀表有限公司;ALpha 1-2 LD plus真空冷凍干燥機(jī)，CHRIST;Direct-Q3超純水一體機(jī)，MERCK MilliPORE;SCQ-8201A超聲波清洗機(jī)，上海聲彥超聲波儀器有限公司;Z323k冷凍離心機(jī)，HERMLE;N-EVAPTM112氮吹儀，南京銘奧儀器設(shè)備有限公司;DEG-200氮?dú)獍l(fā)生器，淄博宏潤(rùn)工貿(mào)有限公司;XW-80A渦旋震蕩器，上海青浦滬西儀器廠;LE324S電子分析天平，SARTORIUS。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

葉部取鮮樣切碎，混合均勻后縮分至150 g。瘤莖部分分2種取樣：瘤狀莖整個(gè)切成薄片，然后混合均勻，四分法縮分至150 g;瘤狀莖表皮取鮮樣，混合均勻后縮分至150 g，瘤狀莖中心肉質(zhì)部分取鮮樣，混合均勻后縮分至150 g。制備后的樣品冷凍保存在-20 ℃冰箱里，然后進(jìn)行冷凍干燥，粉碎，用真空袋裝好，抽真空，在-20 ℃冰箱里保存。

1.2.2 樣品前處理

取樣品凍干粉0.10 g于15 mL離心管中，加入1.5 mL 70%甲醇溶液，在70 ℃水浴鍋中超聲提取10 min，冷卻至室溫后，加入0.5 mL澄清10 g/100 mL乙酸鉛溶液，除去部分蛋白質(zhì)。渦旋1 min，混勻，在4 000 r·min-1離心機(jī)中離心5 min。保存上清液，沉淀再用70%甲醇按上述方法提取2次，合并3次提取液。將提取液在40 ℃水浴下用氮吹儀濃縮至0.1 mL。再用超純水定容至2 mL，渦旋1 min后，用0.22 nm水系濾膜過(guò)濾，供UPLC檢測(cè)。每個(gè)樣品再做2次平行。

1.2.3 色譜檢測(cè)條件

色譜柱：Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：氯化鉀溶液（0.005 mol·L-1）與甲醇的體積比為91∶9。柱溫：30 ℃。檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器。波長(zhǎng)：230 nm。流速：1.0 mL·min-1。進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.007 0 g黑芥子苷標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，即為700 μg·mL-1黑芥子苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取0.001 0 g黑芥子苷標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，即為100 μg·mL-1黑芥子苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。所配制的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

黑芥子苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水分別稀釋成濃度為25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、350 μg·mL-1、700 μg·mL-1系列標(biāo)液，高效液相色譜儀測(cè)定，以保留時(shí)間定性，峰面積定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.5 樣品測(cè)定

按“1.2.3 色譜檢測(cè)條件”，待基線平穩(wěn)后再進(jìn)樣，以目標(biāo)物譜峰的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量計(jì)算樣品中黑芥子苷含量。計(jì)算公式如下：

X=（C×V）/（M×1000） ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（1）

式（1）中的X為樣品中黑芥子苷含量，單位為g·kg-1;C為待測(cè)樣中黑芥子苷濃度，單位為μg·mL-1;V為樣液最后定容總體積，單位為mL;M為樣品質(zhì)量，單位為g。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的建立

在選定的色譜條件下，分別對(duì)一系列濃度的黑芥子苷標(biāo)液進(jìn)行測(cè)定，以黑芥子苷標(biāo)樣的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。

得到的線性回歸方程為y=21.764X-162.08，結(jié)果表明，在25～700 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 7。檢出限以3倍噪聲計(jì)為0.01 g·kg-1。方法的準(zhǔn)確度和精密度可通過(guò)添加回收率實(shí)驗(yàn)來(lái)考察。按上述實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)黑芥子苷加標(biāo)樣品進(jìn)行了含量測(cè)定并計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本方法平均回收率在95%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.6%～3.4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。采用此方法檢測(cè)青菜頭中黑芥子苷的含量，準(zhǔn)確可靠，能夠滿足測(cè)定要求。

2.2 實(shí)際樣品的測(cè)定及器官間差異

本文采用所建立的檢測(cè)方法分別測(cè)定8個(gè)青菜頭的葉、瘤莖、瘤莖表皮、瘤莖里芯等部位的黑芥子苷含量。

從表1和圖4可以看出，青菜頭瘤莖表皮的黑芥子苷含量最高，有7.39 g·kg-1DW;其次是瘤莖，有4.84 g·kg-1 DW;然后是瘤莖里芯，有4.05 g·kg-1 DW;最少的是葉，僅有2.78 g·kg-1 DW。

由表1再看這4個(gè)部位的含量范圍與極差，葉的測(cè)定值極差最大，達(dá)到了5.56 g·kg-1;其次是莖，相差4.39 g·kg-1，說(shuō)明葉和莖的測(cè)定結(jié)果變動(dòng)較大。對(duì)比4個(gè)部位的方差和標(biāo)準(zhǔn)差，葉的方差達(dá)到4.60 g2/kg2之多，標(biāo)準(zhǔn)差為2.15 g·kg-1，其次是莖的方差2.25 g2/kg2、標(biāo)準(zhǔn)差1.50 g·kg-1，表皮的方差1.75 g2/kg2、標(biāo)準(zhǔn)差1.32 g·kg-1，里芯的方差和標(biāo)準(zhǔn)差最低為0.88 g2/kg2和0.94 g·kg-1，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中葉的測(cè)定數(shù)據(jù)離散程度較大，莖、皮、芯的測(cè)定數(shù)據(jù)的離散程度較小，數(shù)據(jù)較集中。葉黑芥子苷含量的變異系數(shù)是77.12%，莖黑芥子苷含量的變異系數(shù)是30.99%，瘤莖表皮黑芥子苷含量的變異系數(shù)是17.89%，瘤莖里芯黑芥子苷含量的變異系數(shù)是23.19%，可見(jiàn)葉黑芥子苷含量的相對(duì)變異程度大，瘤莖表皮黑芥子苷含量的相對(duì)變異程度小。最后從標(biāo)準(zhǔn)誤差分析這4個(gè)部位的差異，葉（0.76）>莖（0.53）>皮（0.47）>芯（0.33），表明本實(shí)驗(yàn)所測(cè)樣品的瘤莖里芯黑芥子苷含量與總體瘤莖里芯的黑芥子苷含量值較接近，對(duì)總體的瘤莖里芯有代表性，以本實(shí)驗(yàn)瘤莖里芯的樣本來(lái)推斷總的瘤莖里芯的黑芥子苷含量可靠度很大;本實(shí)驗(yàn)的莖和瘤葉莖表皮的黑芥子苷含量也能較好地代表總體莖和瘤莖表皮的含量;而本實(shí)驗(yàn)中葉的黑芥子苷含量只能一定程度地代表總體莖瘤芥葉的含量。從這4個(gè)部位的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的青菜頭的皮、芯和瘤莖的黑芥子苷含量的精密度較高，而葉的測(cè)定結(jié)果的精密度則較低。

3 小結(jié)

本文研究了青菜頭中黑芥子苷含量的檢測(cè)方法，并進(jìn)一步試驗(yàn)分析了黑芥子苷含量在青菜頭不同器官間的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑芥子苷在25～700 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），檢出限為0.01 g·kg-1，黑芥子苷的添加回收率為95.0%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～3.4%。說(shuō)明本文所建方法準(zhǔn)確度和精密度符合青菜頭中黑芥子苷含量的測(cè)定要求，且方法前處理快捷簡(jiǎn)便，適合處理大批量樣品。并進(jìn)一步分析了黑芥子苷含量在青菜頭不同器官間的差異。發(fā)現(xiàn)青菜頭各部位的黑芥子苷含量：瘤莖表皮>瘤莖>瘤莖里芯>葉。其中，葉的測(cè)定數(shù)據(jù)離散程度較大，莖、皮、芯的測(cè)定數(shù)據(jù)的離散程度較小，數(shù)據(jù)較集中。

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（責(zé)任編輯：敬廷桃）