一種新型電化學-質譜聯用系統(tǒng)的研制

崔利利 魏忠林 費 強* 李 明

1(吉林大學化學學院，長春 130012) 2(中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所，北京10029)

1 引 言

電化學通過測量電流和電壓的變化研究電極表面和電解質溶液的濃度及電化學反應，因其具有靈敏、快速、價廉等優(yōu)勢而被廣泛使用[1]。然而，僅依靠電信號不能直觀地識別出復雜氧化還原反應的中間體和產物，因此對于電化學反應機理的研究仍存在一定的挑戰(zhàn)。質譜是一種通過對質荷比(m/z)測量直接獲得待測物分子量的分析技術[2]，可以快速鑒定電化學氧化還原反應的中間體和產物，并由此推斷出電化學反應機理。因此，電化學-質譜聯用成為解決電化學現有問題的有力工具[3]。此外，電化學-質譜聯用技術因其快速、高效等優(yōu)勢，在蛋白質組學[4]、藥物代謝[5]等領域具有廣泛應用前景。接口技術是電化學-質譜聯用技術的關鍵。1971年，Bruckenstein等[6]首次將電化學與質譜聯用，利用特氟隆疏水膜直接與多孔電極相連，揮發(fā)性氣體可透過擴散膜并由電子轟擊離子源(Electron impact ion source, EI)進行離子化，從而實現質譜檢測。Hambitzer等[7]利用熱噴霧作為接口，開發(fā)了電化學與質譜聯用系統(tǒng)，并研究了N,N-二甲基苯胺的電化學氧化過程。1995年，電噴霧(Electrospray ionization, ESI)技術首次被用于電化學與質譜的聯用接口[8]。目前，ESI是電化學與質譜聯用系統(tǒng)的主要接口。然而，被施加高電壓的電噴霧針和接地的質譜儀入口構成了一個回路，使ESI源本身成為一個電化學池，能夠誘導發(fā)生氧化或還原副反應[9]。為避免ESI中副反應的發(fā)生，需要實現EC與ESI的分離。

可與質譜聯用的電化學裝置主要包括多孔電解池、薄層電解池和微流體芯片電解池。Bruins研究組采用多孔電解池的EC-MS系統(tǒng)成功模擬了藥物代謝的過程[10]，并實現了電化學代替化學試劑或酶試劑對蛋白質或多肽的裂解[11]。雖然多孔電解池的電極氧化還原效率高，但電極不易清洗。薄層電解池的電極可以通過拋光清洗保持電極表面活性，但薄層電極的氧化還原效率比多孔電極低，所以為了提高其電化學轉換效率，流速通常小于10 μL/min[12]。由于非揮發(fā)性的無機鹽會抑制質譜信號，同時會污染質譜接口和離子透鏡，所以在EC-MS中，通常使用甲酸銨或乙酸銨作為電解質[7]。在EC-MS系統(tǒng)中，可以根據實驗需要選擇電極材料，常用的電極材料包括玻碳電極[13]、鉑電極、汞電極[14]、摻硼的金剛石電極[15]和鈦電極[16]等，但很少有研究者使用玻碳電極進行電化學還原反應。本研究選擇薄層電解池作為電化學反應池，玻碳電極作為工作電極，0.1% (V/V)甲酸作為支持電解質，流速設定為4 μL/min。

在以電噴霧離子源作為電化學與質譜聯用的接口技術時，如在電化學池與質譜儀之間不采取任何措施，直接施加在噴霧針上的高電壓會對電化學恒電位儀電路系統(tǒng)造成損壞。為解決此問題，Kraj等在2013年提出的一種新型快速還原二硫鍵的電化學與質譜聯用的系統(tǒng)中，特別強調電化學池與質譜儀之間接地線的去耦合作用[16]。在此之前，Berkel等已經提出在電化學池的出口與質譜儀之間使用約30 cm的管路線[17]，或在電噴霧質譜系統(tǒng)之前插入一個接地線[18]，或讓整個EC/ESI-MS系統(tǒng)浮在由ESI高電壓誘導的電壓之中[19]，以避免直接施加在噴霧針上的高電壓對電化學恒電位儀的影響。近年來，常壓質譜技術[20,21]的出現，也為解決這一問題提供了新思路。例如，解吸電噴霧(Desorption electrospray ionization, DESI)以高的耐鹽性、結構簡單等優(yōu)勢成功實現了EC-MS的連接，并且電化學池與質譜儀不直接相連，因此不需要去耦合裝置[22]。另外，Bruins在其綜述[23]中也指出，接地的ESI噴霧針可完全消除上游電流的影響。

本研究提出了一種新型電化學與質譜聯用系統(tǒng)，采用噴霧針接地設計的電噴霧離子源作為接口技術，避免了直接施加在噴霧針上的高電壓對電化學恒電位儀的耦合作用，可實現EC和MS的直接在線聯用，并且簡化了儀器結構。為考察儀器性能，以氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)作為模型樣品，考察了多肽在該系統(tǒng)中的氧化還原行為。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)購自Aladdin公司; 二硫蘇糖醇(DTT，Sigma公司); 甲醇(色譜級，Burdick﹠Jackson公司); 甲酸(色譜級，Roe Scientific公司); 谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)購自于本地藥店; 5 mmol/L醋酸銨緩沖液(pH 5.5)用氨水和醋酸配制并調節(jié)pH值。

電化學氧化還原實驗在薄層電化學電池與Bruker HCT高容量離子阱質譜儀(Bruker公司)在線聯用裝置上完成，如圖1所示。由于電噴霧離子源(Bruker公司)采用質譜入口施加反向高電壓的方式對樣品進行離子化，因此噴霧針接地，并不施加任何電壓，這種設計能夠實現EC與ESI高電壓的分離，從而避免電噴霧的高電壓對電化學恒電位儀電路系統(tǒng)的損壞。薄層電化學池包括嵌入在PEEK內直徑為3 mm的雙玻碳工作電極(WE)、Ag/AgCl(3 mol/L NaCl)參比電極(RE)和含有一個小孔的不銹鋼輔助電極(AE)。此電解池由50 μm厚的聚四氟乙烯墊片組成，體積約為7 μL。實驗使用DY2300恒電位儀(日本Digi-Ivy公司)。

圖1 電化學-質譜聯用系統(tǒng)示意圖，包括注射泵、薄層電化學池和離子阱質譜儀Fig.1 Schematic of electrochemistry with mass spectrometry (EC-MS) set up. The device includes a syringe pump, an electrochemical cell and an ion trap mass spectrometer

質譜參數：正離子模式; 毛細管電壓為4000 V; 霧化氣N2的壓力為310 kPa; 干燥氣N2的流速和溫度分別為4.0 L/min和300℃; 質量范圍設為m/z100～650。二級質譜參數：碰撞氣為氦氣，母離子選擇的窗口寬為m/z1.0，碰撞誘導解離(Collision induced dissociation, CID)能量為0.3～1.2 eV。質譜數據處理使用CompassTM軟件(版本4.0)，所列質譜圖均為采集0.3 min的平均值。

2.2 實驗方法

2.2.1氧化型谷胱甘肽(GSSG)的還原采用經典的DTT化學試劑還原二硫鍵[24]： 250 μmol/L氧化型谷胱甘肽溶于含有100 mmol/L DTT的5 mmol/L醋酸銨緩沖溶液(pH 5.5)，在37℃下孵育30 min。立即冷卻樣品，抑制進一步還原。將溶液用甲醇-超純水(1∶1，V/V)稀釋至50 μmol/L，直接進入質譜測試。

在線電化學與質譜聯用系統(tǒng)還原二硫鍵：將氧化型谷胱甘肽凍干粉用含有1%(V/V)甲酸-甲醇(1∶1，V/V)稀釋至250 μmol/L，用氮氣除氧20 min。玻碳電極先在拋光布上用3、1和0.5 μm 的氧化鋁依次拋光，待表面打磨光滑后，在蒸餾水中超聲清洗10 min。樣品溶液由注射泵進樣，以4 μL/min 的流速(圖1紅線)流經電化學池進行電化學反應，反應產物通過不銹鋼電極的小孔流出電化學池，進入電噴霧中進行離子化。同時，恒電位儀施加-1.7 V 恒電壓對樣品進行還原。

2.2.2還原型谷胱甘肽的氧化在線的電化學與質譜聯用系統(tǒng)氧化GSH與還原GSSG的實驗步驟基本相同，不同之處是, 在氧化過程中，施加2.0 V 恒電壓; 還原過程中，施加-1.7 V的恒電壓。

2.2.3樣品的制備取一片谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)研磨，超聲溶解于10 mL超純水中，離心，取上清液，用1%(V/V)甲酸-甲醇(1∶1，V/V)稀釋5倍，待測。

3 結果與討論

3.1 氧化型谷胱甘肽(GSSG)的還原

一個GSSG分子的二硫鍵加氫還原生成兩個GSH分子，兩個GSH分子通過脫氫氧化生成一個GSSG分子，其反應機理如式(1)所示。

(1)

為了考察在線電化學與質譜聯用系統(tǒng)還原二硫鍵的儀器性能，首先使用了文獻中最常采用的化學試劑還原二硫鍵的實驗方法，評估了將肽與過量的DTT在37℃溫育30 min后達到的二硫鍵降低程度。如圖2A所示，經DTT還原后的GSSG，一級質譜圖顯示m/z308(GSH)與m/z613(GSSG)的峰，說明在上述條件下，DTT并未將GSSG完全還原。為了驗證這一推測，分別對m/z308與m/z613進行二級碎裂，如圖2B和圖2C所示，碎片離子的分析結果表明，DTT的確將氧化型谷胱甘肽進行還原，且通過加氫生成了還原型的谷胱甘肽。

圖2 (A)氧化型谷胱甘肽(GSSG)經DTT還原后的一級質譜圖; (B)經DTT還原后的氧化型谷胱甘肽(GSSG)m/z 308的MS/MS圖; (C)經DTT還原后的氧化型谷胱甘肽(GSSG)m/z 613的MS/MS圖Fig.2 (A) Mass spectrum of GSSG after dithiothreitol(DTT) reduction; (B) MS/MS spectrum of GSSG after DTT reduction at m/z 308 ; (C) MS/MS spectrum of GSSG after DTT reduction at m/z 613

對在線電化學與質譜聯用系統(tǒng)還原二硫鍵進行考察。電化學池未施加電壓時，GSSG樣品的質譜圖見圖3，m/z307.1和m/z613.1分別為[GSSG+2H]2+和[GSSG+H]+。當對EC施加-1.7 V 電壓后，[GSSG+2H]2+峰強度下降了83.3%，[GSSG+H]+峰強度下降了88.6%; 并且出現了強度較高的m/z308.1和m/z615.1峰，分別為[GSH+H]+和[2GSH+H]+。為進一步確證GSSG在電化學池中發(fā)生了還原反應，對GSH標準品和GSSG發(fā)生電化學還原后的反應產物m/z308分別進行CID碎裂，結果如圖4所示。圖4A和圖4B的二級質譜圖都含有[M-H2O]+、b2、y2和y2-NH3離子。由此可知，GSSG中的一對二硫鍵通過獲得2個氫原子被還原為GSH(見式(1))。氧化型谷胱甘肽GSSG是2個GSH通過脫氫氧化形成一對鏈間二硫鍵的多肽。在電化學中，很難通過循環(huán)伏安法發(fā)現二硫鍵的還原，但通過電化學-質譜聯用系統(tǒng)，利用質譜進行直觀的分子量測定及串聯技術，能直接觀察到GSSG與GSH之間的轉換。本實驗GSSG的電化學還原結果和生成產物GSH的二級碎裂圖結果與以DESI作為電化學與質譜聯用的接口技術結果[20]一致。

圖3 氧化型谷胱甘肽(GSSG)在電化學池(A)未施加電壓和(B)施加-1.7 V電壓后的質譜圖。插圖為m/z 307.1的放大圖Fig.3 Mass spectra of GSSG (A) without and (B) with a potential of -1.7 V applied to EC. Insets: the enlarged spectra of m/z 307.1

圖4 (A)還原型谷胱甘肽(GSH)標準品的MS/MS譜圖; (B)氧化型谷胱甘肽(GSSG)在電化學池施加-1.7 V電壓后的還原產物m/z 308的MS/MS圖Fig.4 (A) MS/MS spectrum of GSH standard; (B) MS/MS spectrum of on-line reduced GSSG with a potential of -1.7 V applied to EC

對比上述兩個實驗可知，在線電化學與質譜聯用系統(tǒng)可實現多肽中二硫鍵的還原，并且在電化學與質譜聯用的系統(tǒng)中，無需使用有機還原劑等化學試劑，無需樣品前處理，允許直接的電化學還原進行質譜的分析，簡化了實驗操作，體現了此裝置高效快速等優(yōu)勢。同時，基于質譜的碎裂定性功能，可直接對GSSG的還原產物GSH進行結構分析。

3.2 還原型谷胱甘肽(GSH)的氧化

當GSH樣品溶液進入電化學-質譜聯用系統(tǒng)時，獲得的質譜圖如圖5A所示，m/z308.1和m/z615.1分別為[GSH+H]+和[2GSH+H]+。當電化學池施加2.0 V 的恒電位后，[GSH+H]+峰強度下降了71.7%，同時，出現了m/z613.1 [GSSG+H]+信號(如圖5B)。由此可知，GSH在2.0 V的玻碳電極上發(fā)生了電化學氧化反應，生成了GSSG。對比電化學池施加電壓前后的結果可知，施加電壓后確實發(fā)生了電化學反應。如圖5A所示，如若不加電壓，所得結果與直接質譜進樣相同。

圖5 還原型谷胱甘肽(GSH)溶液在電化學池(A)未加電壓(B)施加2.0 V電壓時質譜圖Fig.5 Mass spectra of GSH (A) without and (B) with a potential of 2.0 V applied to EC

為進一步驗證GSSG的生成，對電化學反應產物m/z613進行碎裂，獲得二級質譜圖，并將其與GSSG標準品的二級質譜圖進行對比，結果如圖6所示。GSSH標準品的母離子m/z613.1在CID條件下的MS/MS譜圖見圖6A，m/z595.1為[M+H-H2O]+;m/z484.1為[M+H-E]+，即失去一個谷氨酸殘基的碎片；m/z409.0為[M+H-H2O-E-G]+, 即失去一分子水、一個谷氨酸殘基和一個甘氨酸殘基之后的碎片；m/z355.0為[M+H-2E]+，即失去兩個谷氨酸殘基的碎片。GSH溶液在電化學池施加2.0 V電壓后，產物m/z613.1在CID條件下的MS/MS質譜圖如圖6B。圖6A與圖6B完全一致，表明2個GSH通過電化學氧化失去2個氫原子形成二硫鍵，反應產物為GSSG(式(1)), 同時也表明EC-MS系統(tǒng)能實現GSH中的巰基氧化，并直接對反應產物進行質譜鑒定。

圖6 (A)氧化型谷胱甘肽(GSSG)標準品m/z 613的MS/MS圖；(B)還原型谷胱甘肽(GSH)溶液在電化學池施加2.0 V電壓時氧化產物m/z 613的MS/MS圖。圖中M為GSSGFig.6 (A) MS/MS spectrum of GSSG standard; (B) MS/MS spectrum of GSH with a potential of 2.0 V applied to EC. M represent GSSG

3.3 谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)藥品中GSH的含量測定

為了進一步評價此裝置的性能，對谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)藥品中GSH的含量進行了半定量分析。首先，利用質譜法的二級碎裂對不同GSSG的濃度進行測定。在0.04～2.00 μg/mL范圍內，GSSG碎片離子m/z484.1的強度(y)與GSSG的質量濃度(x)有良好的線性關系，線性方程為y=312312x-28735(R2= 0.98)。

基于上述結果，將0.5 mg/mL GSH以4 μL/min的流速進入電化學與質譜聯用系統(tǒng)，施加2.0 V電壓，對反應生成的m/z613的GSSG進行二級碎裂，根據采集到的碎片離子m/z484.1的強度(26760)，得到生成的GSSG的濃度為0.178 μg/mL。

同時，將稀釋5倍的谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)藥品以同樣的流速進入電化學與質譜聯用系統(tǒng)，獲得的質譜圖如圖7A所示，m/z308.1和m/z615.1分別為[GSH+H]+和[2GSH+H]+。當電化學池施加2.0 V的恒電位后，出現了m/z613.1 [GSSG+H]+信號(圖7B)。同時，對反應生成的m/z613的GSSG進行二級碎裂，采集到的碎片離子m/z484.1的強度(40931)，根據上述線性方程，求出對應的生成GSSG的濃度為0.2231 μg/mL。通過電化學氧化效率的轉換，得出該稀釋后的樣品中GSH的含量為0.6277 mg/mL，則每片谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)藥品中GSH的含量為31.39 mg。

圖7 實際樣品溶液在電化學池(A)未加電壓(B)施加2.0 V電壓時質譜圖Fig.7 Mass spectra of practical sample (A) without and (B) with a potential of 2.0 V applied to EC

4 結 論

提出了一種新型電化學與質譜聯用系統(tǒng)，采用噴霧針接地的電噴霧離子源作為EC-MS的接口, 選擇氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)作為典型樣品，考察了聯用系統(tǒng)的性能。結果表明，在研究巰基的氧化和二硫鍵的還原時，新構建的EC-MS聯用系統(tǒng)具有明顯優(yōu)勢：(1)在本實驗過程中，無需使用有機還原劑等化學試劑，無需樣品前處理，簡化了實驗操作；(2)使用噴霧針接地設計的ESI作為EC-MS聯用的接口，無需去耦裝置，既簡化了儀器結構，又避免了質譜離子源處的高電壓對電化學恒電位儀的損壞；(3)由于質譜定性分析能力強，可通過MS/MS直接對電化學反應產物進行表征。此電化學-質譜系統(tǒng)在電化學反應產物和中間體的鑒定、蛋白質組學、藥物代謝等領域具有良好的應用前景。