HPLC法測定大鼠血漿中膽紅素的含量

柳慶坤 徐 濱 任小榮 齊永秀 李遠(yuǎn)方 李 珂

(1.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016； 2.泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東 泰安 271000)

膽紅素是膽色素的一種，它是血紅蛋白分解代謝后的還原產(chǎn)物。膽紅素的一般定量分析方法有重氮法、分光光度法、熒光法及高效液相色譜法等。嚴(yán)克東等采用重氮化試劑顯色法測定，測得樣品中的總膽紅素含量。王穎等[1]采用雙波長紫外分光光度法測定天然牛黃中膽紅素的含量。吳韻銘[2]利用銅離子在堿性條件下催化氧化膽紅素并與其氧化產(chǎn)物膽綠素形成藍(lán)色配合物的原理，建立了流動注射分光光度法測定人工牛黃中膽紅素。范存霞等[3]用HPLC法測定氨金黃敏顆粒中膽紅素含量，于如海等[4]利用HPLC測定復(fù)方氨酚烷胺顆粒中人工牛黃的含量，朱孝蕓等[5]采用HPLC法對進(jìn)口牛黃、國產(chǎn)牛黃、人工牛黃和培植牛黃中的膽紅素進(jìn)行測定。但對血漿中膽紅素的含量測定方法未見報道。

本研究采用HPLC法建立了大鼠血漿中膽紅素的含量測定方法，分離效率高，專屬性強(qiáng)，靈敏度高。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC-10AT型日本島津高效液相色譜儀、SPD-10A型紫外分光度計[島津儀器(蘇州)有限公司]；KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HANGPING FA1004電子分析天平(上海新科儀器廠)；AP-01P真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠)；高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；移液槍(10～100μl、100～1000 μl)；過濾器(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 材料和試劑

膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號：10077-200604)；甲醇色譜純(山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠；天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心)；二甲基亞砜分析純(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)；冰乙酸分析純(天津市巴斯夫化工有限公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；二氯甲烷分析純(天津市博迪化工有限公司)，氯仿分析純(天津市博迪化工有限公司)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備

精密稱取膽紅素對照品5.6 mg置10 ml棕色容量瓶中，加二甲基亞砜使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 樣品預(yù)處理

取待測血漿50 μl，加入150 μl甲醇，旋渦1 min，離心10 min(12000 r/min)，取20 μl上清液進(jìn)樣分析。

2.3 色譜條件

色譜柱：依利特Hpersil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長為455 nm，流動相為甲醇-1%醋酸(95∶5)，流速為1.0 ml·min-1，進(jìn)樣量為20 μl。

2.4 方法的專屬性試驗

色譜柱：Hpersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(杭州格圖科技有限公司)；流動相：甲醇-1%醋酸溶液(95∶5)；流速：1.0 ml·min-1；檢測波長：455 nm。在此條件下，分別進(jìn)二甲基亞砜空白、膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液、空白血漿、膽紅素-血漿，二甲基亞砜的色譜峰保留時間為3.173、3.282 min，膽紅素的色譜峰保留時間為13.380 min，膽紅素與其他組分能達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按膽紅素的峰計不低于2000,色譜圖見圖1～4。

圖1 空白溶劑二甲基亞砜色譜圖

圖2 空白血漿色譜圖

圖3 膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(色譜峰1、2、3為膽紅素三個同分異構(gòu)體)

圖4 膽紅素-血漿色譜圖

2.5 線性關(guān)系的考察

2.5.1膽紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取膽紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 ml置于10 ml棕色容量瓶中，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液適量稀釋，得到濃度分別為0.56、3.0、6.0、12.0、24.0 μg·ml-1膽紅素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣20 μl，測定峰面積(A)，以A對濃度(C)作線性回歸，得回歸方程A=52681C-26798(r=0.9995)。膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品在0.56～24.0 μg·ml-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.9995)。

2.5.2血漿中膽紅素的線性關(guān)系 精密吸取膽紅素貯備液加入空白血漿，分別得到濃度為17.5、35、70、140、280 μg·ml-1的膽紅素血漿溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣20 μl，測定峰面積A，以A對濃度(C)作線性回歸，得回歸方程A=73131C-999834(r=0.9965)。

2.5.3最低檢出限、定量限 在標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系實驗中，將配制的系列不同濃度溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，當(dāng)信噪比S/N為3∶1時，膽紅素的檢測濃度為0.56 μg·ml-1，相當(dāng)于最低檢出量為0.056 μg。當(dāng)S/N為10∶1時，膽紅素的檢測濃度為1.4 μg·ml-1，相當(dāng)于定量限為0.14 μg。

2.5.4精密度試驗 精密吸取膽紅素對照品溶液20 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，計算峰面積的RSD為1.5%，膽紅素的RSD較小，表明方法精密度良好。

2.5.5回收率 取空白血漿照“2.2”項下預(yù)處理精密加入膽紅素貯備液制成血漿中膽紅素的濃度分別為17.5、70、280 μg·ml-1。各取20 μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算含藥血漿中膽紅素與膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液膽紅素的峰面積之比，兩者之比即為回收率。由表1可知，回收率在80%～120%范圍內(nèi)，本次實驗所測膽紅素3個濃度的平均回收率分別為108.15%、114.73%、102.46%，表明該測定方法準(zhǔn)確度較高。

表1 膽紅素的回收率

3 討 論

3.1 膽紅素色譜峰形的考察

因膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品是膽紅素三個同分異構(gòu)體的混合物[6]，色譜峰很難形成單一的色譜峰，定量以三個峰積分的總面積和計算。

3.2 柱溫的選擇

雖然提高柱溫有利于改善傳質(zhì)和提高分析速度，但由于膽紅素對光和熱不穩(wěn)定，在空氣中遇光、受熱極易氧化[7-8]，所以在配制過程中應(yīng)選用棕色容量瓶，并且應(yīng)在避光環(huán)境中進(jìn)行實驗，所以在室溫條件下進(jìn)行分離分析。

3.3 吸收波長的選擇

本次實驗采用參考文獻(xiàn)[9-10]中的波長455 nm進(jìn)行定量測定，方法可行，分離度較高。

3.4 流動相的選擇

3.4.1流動相的pH值對膽紅素的保留值和峰形都有影響，堿性愈強(qiáng)，其峰形愈尖銳。但是，為了保護(hù)色譜柱，流動相的pH值應(yīng)接近7.1。

3.4.2當(dāng)選擇甲醇-二氯甲烷(或者氯仿)-醋酸做流動相時，沖柱子的方式是先用甲醇沖20 min，再用甲醇-水(10∶90)沖至少20 min，最后用甲醇沖至少20 min。最終使色譜柱保持在甲醇環(huán)境中，以保護(hù)色譜柱。