二氧化鈦納米棒的制備及抗菌性能研究

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

前言

近年來，世界各地嚴(yán)重的水體污染為致病菌的滋生和大量繁殖提供了天然的溫床[1]。泛濫的細(xì)菌嚴(yán)重威脅了人類的生命。因此，抑制致病菌的生長繁殖和傳播，最終殺滅致病菌和病毒已經(jīng)成為當(dāng)前一個(gè)亟待解決的難題。現(xiàn)有的殺滅細(xì)菌的方法主要是通過噴灑藥物的方式，優(yōu)點(diǎn)是滅菌效果明顯且見效快。但缺點(diǎn)是這種方法很容易對(duì)環(huán)境產(chǎn)生二次污染，且長期噴灑藥物會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致細(xì)菌更難被殺滅[2]。因此，如何有效地殺滅細(xì)菌成為急需解決的一道難題。

當(dāng)前，半導(dǎo)體材料為我們提供了一條有效的滅菌途徑[3-4]。當(dāng)用光照射半導(dǎo)體時(shí)，電子(e-)會(huì)被激發(fā)到半導(dǎo)體的導(dǎo)帶上，從而在價(jià)帶上產(chǎn)生空穴(h+)，激發(fā)的電子和產(chǎn)生的空穴分別具有還原性和氧化性，它們能與氧氣及水分子反應(yīng)，生成活性氧物質(zhì)(ROS)，從而起到殺滅細(xì)菌的作用。這種滅菌方式簡(jiǎn)單、方便且不會(huì)污染環(huán)境。在眾多的半導(dǎo)體材料中，納米TiO2半導(dǎo)體材料，由于具有成本低、穩(wěn)定性好和抗菌活性高等優(yōu)勢(shì)而備受研究者的關(guān)注[5]。

通過一種簡(jiǎn)單的水熱法得到了TiO2半導(dǎo)體納米棒材料[6]，所制備樣品為銳鈦礦晶相，這有利于發(fā)揮其光催化活性。在紫外光的照射下，樣品對(duì)革蘭氏陰性菌(綠膿桿菌)具有良好的殺滅效果。

圖1 TiO2納米棒的XRD圖(a)和SEM圖(b)Figure 1 The XRD pattern (a) and SEM image (b) of the TiO2 nanorods.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料及儀器

Ti(SO4)2、乙二胺、無水乙醇、檸檬酸均為分析純?cè)噭B培養(yǎng)基和 MH培養(yǎng)基，磷酸鹽(PBS)緩沖液，綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株。

S-4800型日立掃描電子顯微鏡(日立儀器有限公司)，XRD-6000型X射線粉末衍射儀(日本島津公司)，立式壓力蒸氣滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，1700紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)，GL-150恒溫培養(yǎng)器(上海銀澤儀器設(shè)備有限公司)，DHG-9040A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 二氧化鈦納米棒的制備

0.24 g Ti(SO4)2和0.63 g檸檬酸溶解到14 mL去離子水中。在攪拌下，依次加入8 mL乙二胺和10 mL乙醇。攪拌30 min后轉(zhuǎn)移到50 mL反應(yīng)釜中，在180 ℃反應(yīng)8 h。所得沉淀用無水乙醇和去離子水洗滌幾次。將所得產(chǎn)物在60 ℃干燥箱中干燥12 h，最終得到TiO2納米棒樣品。

1.3 抗菌性能測(cè)試

采用微量稀釋法測(cè)定樣品的最低抑菌濃度(MIC)。

1)將冷凍保存的綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株涂于LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單克隆菌落接種于MH液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)。用MH培養(yǎng)基稀釋過夜菌液至5×105cfu/mL，按90 μL/孔加入到96孔板中；

2)稱取一定量的TiO2粉末于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成預(yù)定濃度懸浮液，然后在高壓鍋內(nèi)用120 ℃的飽和蒸汽滅菌 20 min。然后在無菌操作臺(tái)上用365 nm紫外光下照射懸浮液2 h，按10 μL/孔加入到菌液中，得到0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.5 mg/mL的TiO2納米棒濃度混合液；然后在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h；根據(jù)光密度測(cè)試數(shù)值計(jì)算最低抑菌濃度。

1. 4 樣品表征

使用XRD-6000型X射線粉末衍射儀(XRD)測(cè)試樣品在2θ為10°～70°之間的衍射峰；用Hitachi S-4800型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察樣品的形貌特征；用1700紫外分光光度計(jì)在波長為600 nm處測(cè)定綠膿桿菌的濃度。

2 結(jié)果與討論

2. 1 晶相及形貌分析

眾所周知，TiO2樣品的晶相及形貌影響其性能。而晶相及形貌又決定于反應(yīng)的溫度和時(shí)間。多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，調(diào)節(jié)水熱反應(yīng)的溫度為180 ℃，反應(yīng)時(shí)間為6 h，能夠制備得到合適晶相與完整形貌的TiO2納米棒。如果反應(yīng)溫度過低，得到的樣品非銳鈦礦晶相，不利于樣品的抗菌性能。而反應(yīng)時(shí)間過短，不能得到完整的納米棒形貌，也會(huì)影響樣品的抗菌性能。圖1a所示為最佳反應(yīng)條件下得到的TiO2納米棒的XRD圖。納米棒樣品的衍射峰與標(biāo)準(zhǔn)銳鈦礦相TiO2(PDF#73-1746)的衍射峰一致，說明所得樣品為銳鈦礦相。由于銳鈦礦相相比金紅石和板鈦礦相TiO2的光催化效果更好，因此有利于樣品發(fā)揮光催化抑菌作用。圖1b為所得樣品的SEM圖，可以看出，所得樣品為均一的納米棒，且樣品無團(tuán)聚，分散性良好，長度450 nm左右。

2.2 樣品抑菌性能分析

選擇綠膿桿菌為目標(biāo)菌種，在紫外光照射不同濃度TiO2納米棒溶液2 h后，測(cè)試樣品對(duì)綠膿桿菌的抑菌性能。所得數(shù)據(jù)見圖2。從圖2可以明顯地看出，以對(duì)照樣細(xì)菌的存活率100%為參比，隨著TiO2納米棒濃度的增大，綠膿桿菌的存活率逐漸下降，說明經(jīng)過紫外光照射的TiO2納米棒樣品確實(shí)具有良好殺滅細(xì)菌的作用。尤其是當(dāng)TiO2納米棒樣品的濃度達(dá)到0.2 mg/mL時(shí)，綠膿桿菌的存活率為28.8%，說明在很小劑量TiO2納米棒樣品存在的條件下，就具有很好的滅菌效果。而當(dāng)樣品的濃度增大到0.5 mg/mL時(shí)，綠膿桿菌的存活率僅為4.8%，細(xì)菌基本上已經(jīng)被殺滅。

圖2 綠膿桿菌在不同濃度TiO2納米棒(0～0.5 mg/mL)條件下的存活能力Figure 2 The bacterial viability of P. Aeruginosa exposed to different concentrations (0～0.5 mg/mL) of TiO2 nanorods.

2.3 樣品抑菌性能機(jī)理

為了更好地了解樣品的抗菌性能，圖3詳細(xì)地描述了TiO2納米棒的光催化滅菌機(jī)理。在365 nm紫外光照射下，光生電子從TiO2納米棒的價(jià)帶激發(fā)到其導(dǎo)帶，這些電子會(huì)被TiO2納米棒表面吸附的O2捕獲形成超氧自由基(·O2-)和羥基自由基(·OH)。與此同時(shí)，留在TiO2納米棒的價(jià)帶光生空穴會(huì)和溶液中的H2O和 OH-反應(yīng)生成羥基自由基(·OH)。這些活性氧物質(zhì)(ROS)會(huì)攻擊細(xì)菌并最終破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，并且能夠分解組成細(xì)胞的物質(zhì)，從而使細(xì)菌死亡，起到殺滅細(xì)菌的作用。

TiO2+ hv→h++ e-

H2O + h+→H++·OH

OH-+ h+→·OH

O2+ e-→·O2-→·OOH → H2O2→·OH

圖3 TiO2納米棒的光催化滅菌機(jī)理圖Figure 3 Mechanism of photocatalytic bacterial killing of TiO2 nanorods.

3 結(jié)論

通過一種簡(jiǎn)單的水熱法制備了形貌均一、單分散的TiO2納米棒樣品。所得樣品不需經(jīng)過煅燒處理就為銳鈦礦相。在365 nm紫外光照射后，納米棒樣品對(duì)綠膿桿菌具有良好的殺滅效果，且隨著所用樣品濃度的增大，滅菌效果也逐漸增加。當(dāng)樣品的濃度為0.5 mg/mL時(shí)，TiO2納米棒對(duì)綠膿桿菌的抑菌率達(dá)到95.2%，這為制備具有良好抗菌性能的納米材料提供了一條可行的途徑。