病毒疫苗對預防膽道閉鎖的可行性探討

詹江華，余晨

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是引起新生兒梗阻性黃疸的常見原因之一，Kasai術后進行性的炎性損傷及肝纖維化是制約患兒自體肝生存時限的主要因素。一直以來，BA的診治是小兒外科醫(yī)生面臨的一大難題，關于BA 的病因、治療以及預后的探索從未停止。明確其病因及發(fā)病機制或許可以從根源上解決問題，從而降低發(fā)病率。目前關于BA發(fā)病機制的研究主要集中于以下幾個方面：病毒感染或外源性毒素、遺傳易感性、免疫異常、膽道發(fā)育不成熟或膽管畸形等［1］。其中，BA圍生期病毒學的研究一直是各國研究者探索的熱點話題。

1 病毒與BA的關系

20 世紀70年代，美國兒科醫(yī)生Benjamin Landing提出，膽總管囊腫、新生兒肝炎綜合征與BA的病因學中可能存在一個共同的致病因素，并將其引申為一種嗜肝病毒的影響，而該種病毒能夠作用于膽管引起結構性膽管損傷（嬰兒阻塞性膽管?。?］。近半個世紀的關于BA流行病學及實驗動物學研究表明，BA致病的目標病毒主要鎖定在巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、輪狀病毒（Rotavirus，RV）、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）及呼腸孤病毒（Reovirus，Reo）上，圍生期這些病毒的感染或許是引起B(yǎng)A的真正元兇［3］。

1.1 CMV 與BA CMV 感染與BA 的發(fā)生關系是迄今為止研究最多的。CMV 屬皰疹病毒屬的雙鏈DNA病毒，檢驗發(fā)現CMV包涵體存在于膽道上皮組織中，證明CMV 可感染膽道上皮組織。2018年，國際BA 協作組基于BA 的發(fā)病率及Kasai 手術對于該病的效果制定了新的分型，該分型將BA分為伴發(fā)先天性畸形型和孤立型，其中孤立型中就包括CMV感染型，并指出該型Kasai手術效果不佳［1］。該分型的提出也從側面反映了CMV 可以發(fā)生在BA 的圍生期，持續(xù)存在并加速病情進展，應提起臨床醫(yī)生的關注。同時臨床研究也發(fā)現，CMV感染會延遲或阻礙對BA的診斷及治療，與未檢測到病毒感染的患兒相比，CMV 檢測陽性的患兒其手術日齡普遍延遲［4］。這或許提示我們CMV 感染發(fā)生在圍生期并逐漸起病，而出生后早期并沒有表現出癥狀，從而與先天型相比造成診斷時間上的延遲。

1.2 RV 與BA 雖然BA 的流行病學調查結果眾說紛紜，但其可能存在的地域性和季節(jié)性差異均提示感染因素在BA發(fā)病中的作用，是對病因研究中病毒存在的有力佐證。季節(jié)及氣溫改變對母親孕期和分娩的影響不可忽視，氣溫的降低對胎兒和新生兒生長發(fā)育的環(huán)境、暴露病毒等的作用可能成為BA發(fā)病的原因之一［5］。美國北部及日本的流行病學調查均顯示，秋季（9—11月）BA 的發(fā)病率呈現一個上升的趨勢，與該季節(jié)溫度驟降、輪狀病毒高發(fā)等因素有關［6-7］。

RV 為雙鏈DNA 病毒，可感染肝細胞和膽道上皮細胞。到目前為止，雖然僅有少數文獻報道在人體內檢測到了RV感染的確切證據，但是大部分的動物實驗均表明，新生小鼠感染恒河猴輪狀病毒（Rhesus monkey rotavirus，RRV）后可在短期內產生BA 樣表現，且與人類患病表現具有一定的重疊性，如梗阻性黃疸出現的時間、門管區(qū)膽管增生、肝纖維化、炎性細胞的激活及增多等［3］。這些征象均提示我們RV在BA發(fā)病中的作用不容小覷。

1.3 EBV/Reo 與BA 臨床上多種疾病與EBV 感染均有密切關系，EBV 感染可引起機體幾乎所有臟器和組織的相關疾病。雖然EBV在BA患兒中的檢出率較低，但仍有學者通過顯色原位雜交技術（Chromogenic in Situ Hybridization，CISH），對16例已證實的BA病例中EBV的表達進行了研究，發(fā)現在2例肝細胞和1例膽管上皮細胞中均檢測到了EBV核酸的痕跡，提示病毒可在膽道上皮內滲透繁殖［8］。

Reo 屬呼腸病毒科家族雙鏈RNA 病毒，可引起膽管上皮細胞的凋亡并導致膽道的固有免疫應答，從而引起膽道的梗阻。BA 患兒肝臟中可檢出該病毒顆粒，國外有研究發(fā)現，其在BA 患兒中的檢出率約為32.8%～55%［9-10］。動物實驗證實，幼年小鼠感染該病毒后，即便病毒被清除，但感染后在肝內、肝外膽管和肝臟實質所形成的病理學變化仍然存在，近似于嬰兒BA 的改變。但關于其確切的感染機制還需更多臨床數據的支持。

目前雖然還沒有確切答案，但是種種跡象表明短暫的病毒接觸可以引發(fā)膽管上皮細胞以及肝細胞強烈的炎癥反應，以至于膽管堵塞、膽汁流動受阻、不可避免地發(fā)生肝纖維化和肝硬化。因此吸引著更多的科研人員對其進行不斷探索。

2 病毒疫苗接種對BA預防的啟發(fā)

據前述，病毒感染很有可能是BA發(fā)生的重要原因。因此我們是否可以從其他器官組織對上述病毒進行的預防中得到啟示，進而對BA的發(fā)生發(fā)展施加一定的干預措施？根據現有的文獻分析，已有通過實施疫苗接種達到了控制BA 發(fā)病率的報道。2006年，為了預防RV腹瀉而將RV疫苗作為自費疫苗引入我國臺灣地區(qū)，至2009年底嬰兒群體中RV 疫苗的覆蓋率不斷增加，研究人員發(fā)現在該地區(qū)的BA注冊系統中顯示其發(fā)病率與之前3年相比有了明顯的降低［11］。這或許可以提示我們BA是可預防的，從而找到有效的手段從根源上減少BA的發(fā)生。

2.1 CMV 疫苗 現階段關于病毒預防的疫苗研發(fā)多集中在CMV、RV、EBV，研究較為熱門的是CMV疫苗。CMV 感染是導致新生兒致畸及免疫抑制的主要原因，侵害包括消化、神經、呼吸和血液等系統。兒童感染CMV 多表現為肝脾腫大、黃疸、皮下出血等，并可引發(fā)聽力、視覺等多種后遺癥。從上世紀70年代就有關于人巨細胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）疫苗的研制，目前已進入第三代研發(fā)階段，包括針對靶蛋白的亞單位疫苗以及磷酸蛋白pp65多肽疫苗等，現階段的臨床試驗也表明其對于移植患者、高危人群、育齡婦女的病毒預防具有較好的效果［12］。如由重組HCMV包膜糖蛋白B（gB）/MF59佐劑組成的亞單位疫苗在產后女性中顯示了50%的免疫功效；在移植患者中，（gB）/MF59和DNA 疫苗Trans Vax 限制了術后CMV 毒血癥的發(fā)生［13］。這些試驗的成功有望加速CMV 疫苗商品化的步伐，同時也為我們研究CMV 疫苗接種對預防BA發(fā)生帶來了新的希望。

2.2 RV 疫苗 RV 疫苗是目前研究較為成熟的疫苗之一。RV是引起兒童急性腹瀉的主要原因，但目前尚無特異性治療藥物，疫苗預防是較為有效的手段。目前國內已有口服RV疫苗獲批進入市場，此外其對于BA的預防作用，國內外學者已經開始利用小鼠模型進行相關的探索。小鼠BA模型是用RRV感染新生小鼠并導致其發(fā)生阻塞性膽管病變，該模型為評估預防和治療BA 的措施提供了良好的范例。研究者發(fā)現采用母體免疫接種的方式（雌性母鼠注射帶有非復制輪狀病毒顆?；蚧畹腞RV 病毒顆粒），其血清RV 抗體顯著升高，子代幼鼠感染RRV后不會發(fā)生膽汁淤積［14］。

此外，研究表明基于多肽的RV疫苗具有安全性高、特異性強等優(yōu)點，被認為是一種較好的免疫策略選擇。此前，Zheng 等［15］通過小鼠實驗發(fā)現谷胱甘肽轉移酶（GST）-非結構蛋白（NSP）4（157-170）和NSP4（144-152）可能是輪狀病毒NSP4的細胞毒性T淋巴細胞的表位肽，通過對母鼠進行NSP4（144-152）或NSP4（157-170）的腸外免疫發(fā)現對子代新生小鼠可形成被動免疫，保護其免受RRV 感染，從而降低RRV誘導的子代BA發(fā)病率。該發(fā)現也為研制輪狀病毒NSP4表位肽疫苗奠定了一定的理論基礎。

2.3 EBV疫苗 兒童EBV感染發(fā)病機制復雜、臨床表現多變，可參與淋巴瘤、傳染性單核細胞增多癥等多系統疾病的發(fā)生發(fā)展。此外，EBV感染也是BA患兒肝移植術后常見的病毒感染之一，在免疫缺陷的個體中可導致淋巴細胞增生紊亂，從而導致移植后淋巴組織增生性疾?。≒ost transplant lymphoproliferative disorders，PTLD）的發(fā)生，該病已成為兒童移植術后遠期死亡的主要原因之一［16］。

目前EBV 疫苗的研發(fā)主要聚焦于預防性及治療性疫苗，已有多種疫苗進入臨床試驗階段，結果表明疫苗兼具良好的安全性和免疫原性。預防性疫苗主要以病毒包膜糖蛋白gp350 為靶點，刺激機體產生抗體以阻止病毒感染，用于預防傳染性單核細胞增多癥和PTLD 等。治療性疫苗則以病毒核抗原和潛伏膜蛋白為治療靶點，刺激機體產生特異性細胞免疫，增強T 細胞殺傷腫瘤的作用。國內外均已有針對鼻咽癌等腫瘤免疫治療的疫苗進入臨床試驗［17］。而對于BA 而言，其與EBV 疫苗的關系不僅限于在肝移植術后對EBV 的預防，若是將疫苗接種的時間提前，甚至于在生后就進行，或許可以避免BA的發(fā)生。當然，這一設想的成功實施還有待更多流行病學資料的收集以及動物實驗的佐證。

3 前景展望

誠然，上述部分病毒疫苗的研發(fā)還處于試驗階段，甚至其對BA的預防作用還只是初步的設想。但不可否認的是，疫苗的臨床研究證實了病毒感染與BA 之間的關系，為降低BA 的發(fā)病提供了一個獨特的視角。基于亞洲地區(qū)BA 的高發(fā)病率以及我國每年龐大的新生兒數量，若在疫苗這一關給予足夠的重視和把控，相信可以降低BA的發(fā)病率甚至能從根源上解決BA的發(fā)生。