隨機(jī)質(zhì)控加樣方法在獻(xiàn)血者血液ELISA 法檢測中的應(yīng)用與評(píng)價(jià)

馮友江 俞凱敏(鎮(zhèn)江市中心血站 丹陽分站，江蘇 丹陽 212300)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)因其較高的靈敏度和特異性，一直是我國采供血機(jī)構(gòu)篩查獻(xiàn)血者血液的重要檢測技術(shù)和方法，對(duì)于保障臨床用血的質(zhì)量和安全起到了至關(guān)重要的作用。 目前我國采供血機(jī)構(gòu)對(duì)獻(xiàn)血者的血液篩查已基本實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)化，象ELISA 法檢測主要采用全自動(dòng)加樣儀和全自動(dòng)酶免分析儀，在檢測過程中為方便操作和觀察結(jié)果，采供血機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)(科)人員通常多會(huì)采用酶標(biāo)板固定孔位來做外部質(zhì)控——在每塊酶標(biāo)板第1 豎排(A1—H1)固定孔位設(shè)置空白、陰性、陽性對(duì)照孔與外部陰性、陽性、質(zhì)控孔——但其存在的加樣時(shí)間差多少對(duì)檢測結(jié)果造成影響[1-2]，也難以做到對(duì)酶標(biāo)板每個(gè)孔位的有效監(jiān)測，更難以發(fā)現(xiàn)影響檢測結(jié)果的邊緣效應(yīng)[3]，可能室內(nèi)質(zhì)控顯示在控，但實(shí)際結(jié)果已有偏差，特別是處于臨界值附近的結(jié)果可能是假陽性或假陰性。 為此，近年來國家在推進(jìn)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可時(shí)，明確要求免疫學(xué)檢驗(yàn)的質(zhì)控物的位置不能固定，而要隨機(jī)放置且應(yīng)覆蓋所有酶標(biāo)板檢測孔位，以便更好地監(jiān)測試驗(yàn)的有效性[4-6]。 按此要求，本站對(duì)酶標(biāo)板固定孔位質(zhì)控與隨機(jī)質(zhì)控的加樣方法作了比較和分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)來源 從本站安全輸血標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)(Spring 2016，廣東穿越醫(yī)療科技有限公司)和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理與控制系統(tǒng)(Liswell5.29，煙臺(tái)海深威軟件有限公司)提取本站2022 年5 月—2022 年7 月2 610 名無償獻(xiàn)血者血液傳染性指標(biāo)(HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和抗-TP)的ELIEA 篩查結(jié)果記錄，獻(xiàn)血者年齡18—59(39.6±10.4)歲，男性1 775 名、女性835 名，獻(xiàn)血前健康檢查均達(dá)到相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)[7]；其中初次獻(xiàn)血者1 017 名、重復(fù)(獻(xiàn)血次數(shù)≥2 次)獻(xiàn)血者1 593 名。

1.2 試劑與儀器 HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和抗-TP ELISA 2 次檢測試劑，包括HBsAg 試劑(上?？迫A和廈門英科新創(chuàng)產(chǎn)品)，抗-HCV 試劑、抗-HIV 試劑和抗-TP 試劑(北京萬泰和英科新創(chuàng)產(chǎn)品)，本次研究主要以ELISA 二檢(試劑)的質(zhì)控為對(duì)象，所用試劑為HBsAg(批號(hào)2021125137)、抗-HCV(批號(hào)2021125827)、抗-HIV(批號(hào)2021126628)和抗-TP(批號(hào)2021127536)(廈門英科新創(chuàng)產(chǎn)品)；4 項(xiàng)血液篩查指標(biāo)J 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào)202011024，北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司)。全自動(dòng)加樣儀(8-CH STAR)、全自動(dòng)酶免分析儀(FAME24/20)(瑞士HAMILTON 公司)；實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理與控制系統(tǒng)(Liswell 5.29，煙臺(tái)海深威軟件有限公司)。

1.3 輸血傳染性指標(biāo)ELISA 復(fù)檢的隨機(jī)質(zhì)控 在ELISA 酶標(biāo)板滿板操作時(shí)，采用全自動(dòng)加樣儀常規(guī)加樣與設(shè)置隨機(jī)質(zhì)控孔:將4 項(xiàng)傳染性指標(biāo)的J 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為“日常標(biāo)本”(3.0 mL/支)，分別加入HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和抗-TP 酶標(biāo)板A1 孔、H12 孔及隨機(jī)孔位(加樣量分別為100、10、50、100 μL)[同時(shí)由生產(chǎn)廠家的設(shè)備工程師在加樣系統(tǒng)后臺(tái)以HSL方法編輯器編程，建立a×s 的數(shù)學(xué)模型(a 為O＃1 之間任意隨機(jī)數(shù)，s 為1＃m 之間批檢測標(biāo)本數(shù))]，設(shè)計(jì)不固定位置的質(zhì)控[8]。 加樣結(jié)束后，酶標(biāo)板上全自動(dòng)酶免分析儀檢測:以隨機(jī)孔位質(zhì)控值作為室內(nèi)質(zhì)控判定標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)項(xiàng)目均連續(xù)檢測20 次(d)(1 次/d)，再按孔位不同分為A1、H12 組和隨機(jī)3 個(gè)組[檢測結(jié)果20(次)個(gè)/組]，利用實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理與控制系統(tǒng)(Levey-Jennings 質(zhì)控圖法[9])繪制出隨機(jī)孔位的室內(nèi)質(zhì)控(框架)圖，將各個(gè)檢測項(xiàng)酶標(biāo)板相對(duì)應(yīng)的A1 組、H12 組結(jié)果繪制入質(zhì)控圖中做比較分析。

1.4 隨機(jī)質(zhì)控限的設(shè)定與判定規(guī)則 質(zhì)控結(jié)果(數(shù)據(jù))[標(biāo)本吸光度(S)/臨界值(CO)]以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)”表示，質(zhì)控限以“s倍數(shù)”表示，當(dāng)質(zhì)控結(jié)果在ˉx±2s之間為“在控”，在ˉx±(2—3s)內(nèi)(1—2s)判定為“告警”，在ˉx±3s之外(1—3s)、或2 個(gè)(次)連續(xù)質(zhì)控結(jié)果均在ˉx±2s(2—2s)之外、或7個(gè)(次)連續(xù)質(zhì)控結(jié)果落在ˉx的同一側(cè)(7ˉx)、或7 個(gè)連續(xù)的質(zhì)控結(jié)果呈現(xiàn)出向上或向下趨勢(7T)均為“失控”。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包(美國IBM)做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料[變異系數(shù)(CV)]用“百分率(%)”表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料(S/CO值)用“ˉx±s”表示，2 組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)做組間兩兩比較；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨機(jī)質(zhì)控法應(yīng)用于血站血液傳染性指標(biāo)復(fù)檢 獻(xiàn)血者輸血傳染性指標(biāo)ELISA 法復(fù)檢隨機(jī)質(zhì)控(法)水平(S/CO)均值:A1 組＞隨機(jī)組＞H12 組，與3 個(gè)組加權(quán)平均值比較，只有隨機(jī)組每項(xiàng)指標(biāo)均無明顯差異(P＞0.05)；與隨機(jī)組比較，A1組每項(xiàng)的平均值明顯升高(P＜0.05)、H12 組每項(xiàng)的平均值偏低(P＜0.05)，CV值皆差異甚微(P＞0.05)(表1)。

表1 隨機(jī)質(zhì)控法應(yīng)用于輸血傳染性指標(biāo)ELISA 復(fù)檢效果 (S/CO)

2.2 血站血液傳染性指標(biāo)復(fù)檢的隨機(jī)(法)質(zhì)控圖 采用實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理與控制系統(tǒng)繪制出ELISA 法復(fù)檢酶標(biāo)板隨機(jī)組結(jié)果的室內(nèi)質(zhì)控(框架)圖，將各個(gè)檢測項(xiàng)酶標(biāo)板相對(duì)應(yīng)的A1、H12 組質(zhì)控結(jié)果繪制入圖:隨機(jī)法HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 復(fù)檢質(zhì)控圖[20 個(gè)(次)檢測(點(diǎn))]中，出現(xiàn)了6 個(gè)點(diǎn)(HBsAg 3 次、抗-HCV 1 次、抗-HIV 2 次)位于ˉx±(2s～3s)之間，這當(dāng)中除H12 組只有1 個(gè)位點(diǎn)于ˉx－2s外(圖1-A)，A1 位組有5 個(gè)點(diǎn)位于ˉx＋2s外(圖1-A，B，C)。

圖1 輸血傳染性指標(biāo)(HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和TP)ELISA 復(fù)檢隨機(jī)(孔)法室內(nèi)質(zhì)控圖

3 討論

近年來，隨著與無償獻(xiàn)血及血站建設(shè)法制化的推進(jìn)和落實(shí)，以及國家對(duì)血站財(cái)政投入的增加，血液檢測的新技術(shù)、新設(shè)備已快速地在血站中應(yīng)用，血液檢測已邁上了自動(dòng)化、信息化、標(biāo)準(zhǔn)化正軌，使得臨床供(用)血的質(zhì)量安全得到了有效的保障。 這特別體現(xiàn)在目前我國血站常用ELISA 法對(duì)獻(xiàn)血者血液傳染性指標(biāo)的檢測基本實(shí)現(xiàn)了從加樣到過程處理、結(jié)果分析全自動(dòng)化，部分發(fā)達(dá)地區(qū)的血站甚至采用了全自動(dòng)流水線檢測，不但檢測結(jié)果準(zhǔn)確、檢測時(shí)間縮短，而且檢測結(jié)果報(bào)告的發(fā)放更加及時(shí)，有效提升了臨床供血的保障水平。

ELISA 法檢測方式的進(jìn)步勢必也要有與之匹配的質(zhì)控方法，如雖然加樣采用了全自動(dòng)加樣儀操作，但是在給整塊酶標(biāo)板滿板加樣時(shí)，加樣時(shí)間一般會(huì)在12—15 min，也就意味著第1 個(gè)和最后1 個(gè)標(biāo)本加入時(shí)差≥12 min[2]，需要有合適的質(zhì)控方法。 本組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，獻(xiàn)血者HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和抗-TP ELISA 法復(fù)檢采用隨機(jī)法質(zhì)控水平(S/CO)均值比較，3 個(gè)組為A1 組＞隨機(jī)組＞H12 組(P＜0.05)(表1)，足見ELISA 法酶標(biāo)板第1 排孔與最末排孔加樣時(shí)差(≥12 min)對(duì)病原體抗原抗體反應(yīng)(ELISA 法檢測結(jié)果)的影響:檢測時(shí)A1 孔中的標(biāo)本反應(yīng)時(shí)間比H12 孔中的標(biāo)本起碼多12 min，所以檢測(質(zhì)控)水平相對(duì)較高。 隨機(jī)質(zhì)控組質(zhì)控水平與3 組加權(quán)平均值相近(P＞0.05)，是由于隨機(jī)組的質(zhì)控加樣[在酶標(biāo)板(孔)中隨機(jī)加樣]的時(shí)差介于A1—H12孔，平均加樣時(shí)間約為1 塊酶標(biāo)板整板加樣時(shí)間的一半——有研究顯示控制ELISA 法檢測加樣時(shí)差＜10 min，對(duì)其檢測結(jié)果的影響甚小(P＞0.05)[2]——因此隨機(jī)質(zhì)控不但能夠保證檢測水平，而且可有效減少人為設(shè)置固定孔位質(zhì)控引起的系統(tǒng)誤差；另外，還可以發(fā)現(xiàn)可能存在的邊緣效應(yīng)對(duì)ELISA檢測結(jié)果的影響，從而保障血液檢測結(jié)果的可靠性[2-5]。

在我們采用隨機(jī)質(zhì)控法[以隨機(jī)質(zhì)控為框架(標(biāo)準(zhǔn))]制定的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和抗-TP ELISA 復(fù)檢質(zhì)控圖中，連續(xù)檢測酶標(biāo)板A1 孔(組)，有5 個(gè)點(diǎn)(5 次檢測)ˉx＋2s外，H12 孔(組)有1 個(gè)點(diǎn)(1 次檢測)位于ˉx－2s外，亦即該質(zhì)控圖發(fā)生過6 次“告警”(圖1)。 設(shè)想如果我們始終將質(zhì)控物設(shè)置在酶標(biāo)板第1 排的固定孔位，其結(jié)果勢必會(huì)對(duì)整板檢測結(jié)果的判斷造成一定的影響，特別是對(duì)于判斷處在臨界值附近的低濃度傳染性性標(biāo)志物標(biāo)本的結(jié)果判斷存在一定難度(也就多了一分風(fēng)險(xiǎn))——這也正是我們將A1 和H12 孔設(shè)為研究對(duì)象的初衷。 雖然影響ELISA 法檢測室內(nèi)質(zhì)控的原因除與酶標(biāo)板固定質(zhì)控孔位設(shè)置相關(guān)外，還與人員試驗(yàn)操作、設(shè)備參數(shù)設(shè)定、試劑貯存及其室溫平衡、實(shí)驗(yàn)室溫濕度、質(zhì)控品反復(fù)凍融與混勻等多方面因素有關(guān)[10-20]，除了血站檢驗(yàn)(科)人員在檢測時(shí)必須嚴(yán)格按照試劑與儀器說明書操作，做好日常的設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)，設(shè)備定期校驗(yàn)，定期核查設(shè)備參數(shù)與試劑說明書的一致性外，還要建立合適的質(zhì)控方法，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制，確保檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

綜上，隨機(jī)(加樣)質(zhì)控法應(yīng)用在血站ELISA 法血液篩查中是科學(xué)和合理的，首先可有效減少因人為設(shè)置固定孔位質(zhì)控引起的系統(tǒng)誤差，其次便于發(fā)現(xiàn)ELISA 酶標(biāo)板外周孔可能存在邊緣效應(yīng)對(duì)檢測結(jié)果的影響。 血站為確保和加強(qiáng)獻(xiàn)血者血液篩查的質(zhì)量和能力，其檢驗(yàn)(科)人員在用ELISA法做相關(guān)檢測時(shí)，應(yīng)對(duì)“人、機(jī)、料、法、環(huán)、信”等每一環(huán)節(jié)做嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控，才能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、及時(shí)性和有效性。 需特別說明的是，由于不同廠家全自動(dòng)加樣儀加樣程序的系統(tǒng)平臺(tái)和設(shè)計(jì)理念不同，對(duì)于隨機(jī)質(zhì)控位的自動(dòng)化算法還需廠家工程師的配合和編程，本隨機(jī)(加樣)質(zhì)控法目前僅在HAMILTON 公司STAR 全自動(dòng)加樣儀中加以實(shí)現(xiàn)，對(duì)于其他廠家的全自動(dòng)加樣儀還有待今后的進(jìn)一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。