美花圓葉筋骨草化學(xué)成分研究

楊 凡，王利霞，唐 飛，閆洪玲，沈曉飛，張 梅，趙文吉，譚玉柱*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國家實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137；2四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院，成都 610041；3四川省草原科學(xué)研究院，成都 610097

美花圓葉筋骨草AjugaovalifoliaBur.et Franch.var.calantha(Diels ex Limpricht) C.Y.Wu et C.Chen為唇形科(Labiate)筋骨草屬(AjugaLinn.)植物,產(chǎn)于四川西部及西北部、甘肅西南部，是藏藥達(dá)巴巴的來源之一[1-3]。其性味苦寒，功效清熱解毒、涼血消腫，全草藥用可治療浮腫后流黃水、關(guān)節(jié)積黃水、骨松質(zhì)發(fā)炎、筋骨疼痛等癥[3]。其療效顯著，民間應(yīng)用廣泛。但關(guān)于其化學(xué)成分和藥理活性的現(xiàn)代研究鮮有報(bào)道。課題組前期研究表明，筋骨草屬主要含有二萜、甾體、黃酮等成分[4]。本文在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究，為筋骨草屬藥用資源開發(fā)奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用70%丙酮水對(duì)美花圓葉筋骨草進(jìn)行冷浸提取，減壓濃縮后采用系統(tǒng)溶劑法得到各個(gè)萃取部位，通過多種色譜分離技術(shù)從乙酸乙酯部位中分離得到12個(gè)化合物，分別鑒定為2-methoxy-4-(2-propenyl)-phenyl-β-D-glucopyranoside(1)、oct-1-en-3-yl-β-glucopyranoside(2)、異地黃苷(3)、20-羥基蛻皮素-20,22-單丙酮化合物(4)、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、(2S)-3-O-octadeca-9Z,12Z,15Z-trienoylglyceryl-O-β-D-galactopyranoside(6)、地黃苷(7)、乙酰哈巴苷(8)、水龍骨素 B(9)、香草乙酮(10)、筋骨草內(nèi)酯(11)、α-(9Z,12′Z,15′Z)-octadecatrienoic acid monoglyceride(12)?；衔?～6、8、12為首次從該屬植物中分離得到，化合物1～9，11～12為首次從該種植物中分離得到。本研究對(duì)分離得到的化合物3、4、7、9、11進(jìn)行了抗炎活性和PHGDH抑制活性的測定，旨在為該種藏藥資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

Avance 400 MHz 超導(dǎo)核磁共振儀(德國Bruker公司)；LC50型中高壓制備一體機(jī)(賽譜銳思北京科技有限公司)；酶標(biāo)儀(美國Fisher公司)；Sephadex LH-20色譜填料(瑞士Pharmacia公司)；MCI樹脂(日本三菱化學(xué)公司)；硅膠GF254薄層預(yù)制板(青島海洋化工廠)；200 ～ 300目柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)；色譜純甲醇(美國TEDIA 公司)；氘代試劑(美國CIL公司)；優(yōu)普UPT系列超純水(成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司)；其他試劑為分析純(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；LPS(中國上海Sigma公司， L-2880)；RAW264.7細(xì)胞株(中國科學(xué)院細(xì)胞庫，上海)；DMEM + 10% FBS + 1% 雙抗(青霉素，鏈霉素)(美國Hyclone公司)；CCK8，BAY 11-7085，Griess試劑(中國Beyotime公司)。

美花圓葉筋骨草于2017年12月采收于四川阿壩紅原縣邛溪鎮(zhèn)，經(jīng)中國科學(xué)院植物研究所系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王強(qiáng)副研究員鑒定為唇形科筋骨草屬植物美花圓葉筋骨草AjugaovalifoliaBur.et Franch.var.calantha(Diels ex Limpricht) C.Y.Wu et C.Chen，樣品標(biāo)本(JGC-1712)現(xiàn)存于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)1001研究室。

2 提取與分離

美花圓葉筋骨草干燥全草6 kg，粉碎后用70%丙酮水溶液室溫冷浸提取5次，濃縮提取液，依次用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯部位(210 g)經(jīng) MCI脫色素，再經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇，10∶1 ～ 1∶1)梯度洗脫，薄層檢識(shí)，合并相同流分，減壓回收溶劑，得到6個(gè)組分 Fr.1 ～ Fr.6 。Fr.3 經(jīng)中壓制備色譜(甲醇-水，30∶70 ～ 100∶0 )梯度洗脫，薄層檢識(shí)，合并相同流分，得到流分Fr.3.1 ～ Fr.3.8 ；Fr.3.3 經(jīng)半制備 HPLC(甲醇-水，60∶40)分離得到化合物1(7 mg)和化合物2(5 mg)；Fr.3.4 經(jīng)半制備 HPLC(甲醇-水，75∶25)分離得到化合物11(7 mg)和化合物4(8 mg)；Fr.3.6 經(jīng)半制備 HPLC(甲醇-水，70∶30)分離得到化合物8(5 mg)。Fr.4 經(jīng) Sephadex LH-20 凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇，4∶6)洗脫，薄層檢識(shí)，合并相同流分，得到流分Fr.4.1 ～ Fr.4.5 ；Fr.4.2 經(jīng)半制備 HPLC(甲醇-水，70∶30)分離得到化合物12(12 mg)；Fr.4.3 經(jīng)半制備 HPLC(甲醇-水，70∶30)分離得到化合物5(5 mg)； Fr.4.4 經(jīng)半制備 HPLC(甲醇-水，60∶40)分離得到化合物3(4 mg)和化合物6(3 mg)和化合物9(5 mg)。Fr.5 經(jīng)半制備 HPLC(甲醇-水，60∶40)分離得到化合物7(7 mg)和化合物10(5 mg)。

3 生物活性測定

3.1 抗炎活性篩選

取指數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7鋪于24孔板(2.5 × 105細(xì)胞/孔)，在37 °C、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，過夜，用50 μM濃度的單體化合物預(yù)處理2小時(shí)后，再加入LPS(0.5 μg/mL)反應(yīng)24小時(shí)。以BAY 11-7085為陽性對(duì)照，通過Griess反應(yīng)評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)基中的NO水平。

3.2 PHGDH抑制活性測定

將人源PHGDH基因(1-310)克隆至pET16載體，其N端攜帶有6×His標(biāo)簽。隨后將載體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21，28 °C培養(yǎng)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。待菌液吸光度達(dá)到0.6～1.0(600 nm)，超聲破碎細(xì)菌，Ni柱純化，測定濃度后-80 °C凍存?zhèn)溆谩Ｅ渲扑柙噭?/p>

Mix1:0.1 mM 3-PG;0.1 mM resazurin;4 mM NAD+;0.001 U/μL diaphorase(30 μL)

Mix2:單體化合物(50 μL，25 μM)+ 0.5 μM PHGDH(20 μL)

首先將Mix2加入到96孔板中，于室溫下孵育20 min。隨后加入Mix1，使得總體系達(dá)到100 μL，室溫繼續(xù)孵育45 min。以CBR-5884為陽性對(duì)照，以550 nm激發(fā)，590 nm檢測各孔吸光度值。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z349.125 9[M+Na]+(計(jì)算值為349.126 3)，相對(duì)分子量326，分子式C16H22O7；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.09(1H,d,J=8.3 Hz,H-6),6.83(1H,d,J=2.0 Hz,H-3),6.73(1H,dd,J=8.3,2.0 Hz,H-5),6.01～5.90(1H,m,H-8),5.09～5.00(2H,m,H-9),4.85(1H,d,J=7.4 Hz,H-1′),3.87(1H,dd,J=12.0,1.6 Hz,H-6′b),3.84(3H,s,2-OCH3),3.72-3.67(1H,m,H-6′a),3.52～3.33(6H,m,H-7,2′,3′,4′,5′);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:151.0(C-2),146.5(C-1),139.1(C-8),136.7(C-4),122.3(C-5),118.5(C-6),116.0(C-9),114.4(C-3),103.3(C-1′),78.3(C-5′),78.0(C-3′),75.1(C-2′),71.5(C-4′),62.7(C-6′),56.9(2-OCH3),40.9(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，故鑒定化合物1為2-methoxy-4-(2-propenyl)-phenyl-β-D-glucopyranoside。

化合物2 白色粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z313.162 4[M+Na]+(計(jì)算值為313.162 7)，相對(duì)分子量290，分子式C14H26O6；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:5.88(1H,ddd,J=17.3,10.4,7.1 Hz,H-2),5.20(1H,dt,J= 17.3,1.4 Hz,H-1a),5.09(1H,dt,J=10.4,1.4 Hz,H-1b),4.32(1H,d,J=7.8 Hz,H-1′),4.12(1H,td,J=7.1,5.8 Hz,H-3),3.81(1H,dd,J=11.9,2.5 Hz,H-6′a),3.64(1H,dd,J=11.9,5.5 Hz,H-6′b),3.39～3.14(4H,m,H-2′,3′,4′,5′),0.90(3H,t,J=6.8 Hz,H-8 );13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:141.2(C-2),116.1(C-1),103.3(C-1′),83.0(C-3),78.4(C-5′),77.9(C-3′),75.5(C-2′),71.8(C-4′),62.9(C-6′),35.8(C-4),33.1(C-6),25.8(C-5),23.8(C-7),14.5(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，故鑒定化合物2為 oct-1-en-3-yl-β-gluco-pyranoside。

化合物3 黃色油狀物(甲醇)；ESI-MS：m/z675.226 3[M+Na]+(計(jì)算值為675.223 0)，相對(duì)分子量652，分子式C31H40O15；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.63(1H,d,J=15.9 Hz,H-7′′′),7.16(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′′′),7.02(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6′′′),6.80(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′′′),6.76(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.69(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.61(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6),6.39(1H,d,J=15.9 Hz,H-8′′′),5.17(1H,d,J=1.9 Hz,H-1′′),4.51(1H,dd,J=11.9,2.3 Hz,H-6′),4.38(1H,dd,J=11.9,6.2 Hz,H-6′),4.33(1H,d,J=7.9 Hz,H-1′),3.99(1H,dd,J=9.1,2.8 Hz,H-5′′),3.95(1H,dd,J=3.5,1.8 Hz,H-2′′),3.86(3H,s,3′′′-OCH3),3.85(1H,m,H-7),3.79(1H,m,H-7),3.75(3H,s,4-OCH3),3.72(1H,d,J=3.3 Hz,H-3′′),3.69(1H,d,J=3.2 Hz,H-5′)2.80(2H,t,J=7.5 Hz,H-8),1.25(3H,d,J=6.2 Hz,H-6′′);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:169.2(C-9′′′),150.9(C-4′′′),149.6(C-3′′′),147.7(C-3),147.5(C-7′′′),147.3(C-4),132.9(C-1),127.9(C-1′′′),124.4(C-6′′′),121.3(C-6),117.2(C-5),116.7(C-5′′′),115.5(C-8′′′),113.0(C-2),111.9(C-2′′′),104.6(C-1′),102.9(C-1′′),84.3(C-3′),75.8(C-2′),75.6(C-5′),74.2(C-4′′),72.5(C-2′′),72.5(C-3′′),72.4(C-7),70.7(C-4′),70.2(C-5′′),64.8(C-6′),56.6(3′′′,4-OCH3),36.9(C-8),18.0(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致，故鑒定化合物3 異地黃苷。

化合物4 白色粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z543.328 8[M+Na]+(計(jì)算值為543.3298)，相對(duì)分子量520，分子式C30H48O7；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:5.81(1H,d,J=2.3 Hz,H-7),3.95(1H,d,J=3.2 Hz,H-3),3.83(1H,dt,J=12.1,4.0 Hz,H-2),3.15(1H,dd,J=10.6,7.3 Hz,H-9),1.39(3H,s,H-29),1.32(3H,s,H-30),1.21(3H,s,H-21),1.20(3H,s,H-26),1.18(3H,s,H-27),0.96(3H,s,H-19),0.83(3H,s,H-18);13C NMR(CD3OD,100 MHz )δ:206.6(C-6),167.8(C-8),122.3(C-7),108.2(C-28),86.0(C-22),85.5(C-14),83.5(C-20),71.3(C-25),68.9(C-2),68.7(C-3),52.0(C-5),50.7(C-17),49.2(C-13),42.4(C-24),39.4(C-10),37.5(C-1),35.3(C-9),32.8(C-4),32.5(C-12),31.9(C-15),29.6(C-26),29.5(C-27),29.1(C-29),27.3(C-30),24.9(C-23),24.6(C-19),22.7(C-21),22.6(C-16),21.7(C-11),17.8(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物4 為20-羥基蛻皮素-20,22-單丙酮化合物。

化合物5 黃色油狀物(甲醇)；ESI-MS：m/z315.178 1[M+Na]+(計(jì)算值為315.178 4)，相對(duì)分子量292，分子式C14H28O6；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:4.24(1H,d,J=7.8 Hz,H-1′),3.89 -3.86(1H,m,H-8),3.85 -3.82(1H,m,H-6′a),3.69 -3.67(1H,m,H-6′b),3.55 -3.51(1H,m,H-8),3.37 -3.33(1H,m,H-3′),3.28 -3.26(2H,m,H-4′,5′),3.17 -3.13(1H,m,H-2′),1.61(2H,d,J=7.4 Hz,H-7),1.32 -1.28(10H,m,H-2,3,4,5,6),0.90(3H,t,J=6.9 Hz,H-1);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:104.6(C-1′),78.3(C-3′),78.1(C-5′),75.3(C-2′),71.9(C-4′),71.1(C-8),63.0(C-6′),33.2(C-7),31.0(C-6),30.7(C-5),30.6(C-4),27.3(C-3),23.9(C-2),14.5(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物5為n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6 黃色油狀物(甲醇)；ESI-MS：m/z537.153 3[M+Na]+(計(jì)算值為537.152 5)，相對(duì)分子量514，分子式C27H46O9；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:5.44～5.25(6H,m,H-9′′),4.23(1H,d,J=7.5 Hz,H-1′),4.19 -4.10(2H,m,H-3),4.02～3.94(1H,m,H-1),3.91(1H,dd,J=10.5,5.2 Hz,H-1),3.83(1H,dd,J=3.3,1.1 Hz,H-4′),3.74(1H,m,H-6′a),3.66(1H,dd,J=10.5,4.6 Hz,H-6′b),3.57 -3.53(1H,m,H-2′),3.52 -3.49(1H,m,H-5′),3.47(1H,dd,J=9.7,3.3 Hz,H-3′),2.81(4H,t,J=6.0 Hz,H-11′′,14′′),2.35(2H,t,J=7.5 Hz,H-2′′),2.08(4H,m,H-17′′,8′′),1.62(2H,m,H-3′′),1.43 -1.27(8H,m,H-4′′,5′′,6′′,7′′),0.97(3H,t,J=7.5 Hz,H-18′′);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:175.6(C-1′′),132.9(C-16′′),131.2(C-15′′),129.4(C-12′′),129.3(C-13′′),129.0(C-10′′),128.4(C-9′′),105.5(C-1′),76.9(C-5′),75.0(C-3′),72.7(C-2′),72.0(C-1),70.4(C-4′),69.8(C-2),66.7(C-3),62.6(C-6′),35.1(C-2′′),30.8(C-4′′),30.4(C-5′′),30.3(C-6′′),30.3(C-7′′),28.3(C-8′′),26.7(C-14′′),26.6(C-11′′),26.1(C-3′′),21.6(C-17′′),14.8(C-18′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，故鑒定化合物6為(2S)-3-O-octadeca-9Z,12Z,15Z-trienoyl-glyceryl-O-β-D-galactopyranoside。

化合物7 棕黃色油狀物(甲醇)；ESI-MS：m/z675.223 7[M+Na]+(計(jì)算值為675.223 0)，相對(duì)分子量652，分子式C31H40O15；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.65(1H,d,J=15.9 Hz,H-7′′′),7.18(1H,d,J=1.4 Hz,H-2′′′),7.07(1H,dd,J=8.2,1.4 Hz,H-6′′′),6.81(2H,d,J=8.2 Hz,H-5,5′′′),6.73(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.67(1H,dd,J=8.2,1.8 Hz,H-6),6.36(1H,d,J=15.9 Hz,H-8′′′)，5.20(1H,brs,H-1′′),4.92(1H,t,J=9.1 Hz,H-4′),4.37(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′),3.87(3H,s,4-OCH3),3.80(3H,s,4′′′-OCH3),3.3～4.2(7H,m,H-2′,3′,5′,6′,4′′,5′′,7),2.81(2H,m,H-8),1.16(1H,d,J=6.2 Hz,H-6′′);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:168.4(C-9′′′),150.9(C-4′′′),149.5(C-3′′′),148.0(C-7′′′),147.7(C-3),147.5(C-4),133.0(C-1),127.8(C-1′′′),124.5(C-6′′′),121.3(C-6),117.2(C-5),116.7(C-5′′′),115.3(C-8′′′),113.0(C-2),112.0(C-2′′′),104.3(C-1′),103.1(C-1′′),81.6(C-3′),76.3(C-2′),76.2(C-5′),73.9(C-4′′),72.5(C-2′′),72.3(C-7),72.2(C-3′′),70.8(C-4′),70.5(C-5′′),62.5(C-6′),56.7(4-OCH3),56.6(4′′′-OCH3),36.7(C-8),18.6(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，故鑒定化合物7為地黃苷。

化合物8 棕黃色油狀物(甲醇)；ESI-MS：m/z429.317 8[M+Na]+(計(jì)算值為429.319 2)，相對(duì)分子量406，分子式C17H26O11；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:6.38(1H,d,J=6.4 Hz,H-3),6.07(1H,d,J=1.3 Hz,H-1),4.91(1H,dd,J=6.4,1.4 Hz,H-4),4.59(1H,d,J=7.9 Hz,H-1′),4.29(1H,t,J=6.6 Hz,H-6′),3.89(1H,dd,J=12.0,1.7 Hz H-6′),3.71(1H,d,J=5.4 Hz,H-6),2.86(1H,s,H-9),2.18(1H,d,J=15.1 Hz,H-7),2.01(3H,s,H-12),1.95(1H,dd,J=15.1,4.5 Hz,H-7),1.46(3H,s,H-10);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:173.4(C-11),144.0(C-3),107.1(C-4),100.1(C-1′),94.7(C-1),88.8(C-8),78.3(C-6),77.8(C-3′),77.7(C-5′),74.7(C-2′),73.5(C-5),71.9(C-4′),63.0(C-6′),55.7(C-9),46.2(C-7),22.6(C-10),22.3(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，故鑒定化合物8為乙酰哈巴苷。

化合物9 無色油狀物(甲醇)；ESI-MS：m/z519.294 4[M+Na]+(計(jì)算值為519.293 4)，相對(duì)分子量496，分子式C27H44O8；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:5.86(1H,d,J=2.6 Hz,H-7 ),4.02～3.92(2H,m,H-2,3),3.20(1H,m,H-22),1.21(3H,s,H-27),1.20(3H,s,H-26),1.19(3H,s,H-21),0.92(3H,s,H-19)，0.90(3H,s,H-18);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:202.5(C-6),167.5(C-8),120.7(C-7),85.2(C-14),80.5(C-5),78.6(C-22),78.0(C-20),71.4(C-25),70.4(C-3),68.6(C-2),50.6(C-17),48.1(C-13),45.6(C-10),42.5(C-24),39.2(C-9),36.3(C-4),34.4(C-1),32.7(C-12),31.9(C-15),29.9(C-27),29.1(C-26),27.5(C-23),22.7(C-11),21.6(C-16),21.2(C-21),18.2(C-19),17.1(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，故鑒定化合物9為水龍骨素 B。

化合物10 無色晶體(甲醇)；ESI-MS：m/z167.071 0[M+H]+(計(jì)算值為167.070 8)，相對(duì)分子量166，分子式C9H10O3；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.52～7.49(2H,m,H-6,2),6.92(1H,d,J=8.7 Hz,H-5),3.92(3H,s,3-OCH3),2.53(3H,s,H-8);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:197.0(C-7),150.6(C-4),146.8(C-3),130.3(C-1),124.2(C-6),113.9(C-2),109.9(C-5),56.2(3-OCH3),26.3(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，故鑒定化合物10為香草乙酮。

化合物11 黃色油狀物(甲醇)；ESI-MS：m/z525.402 8[M+ Na]+(計(jì)算值為525.404 4)，相對(duì)分子量502，分子式C29H42O7；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:5.98(1H,d,J=2.4 Hz,H-7),4.20(1H,dd,J=12.6,4.1 Hz,H-22),3.98(1H,d,J=2.9 Hz,H-3),3.85～3.78(1H,m,H-2),3.55(1H,t,J=10.6 Hz,H-9),2.93(1H,t,J=9.1 Hz,H-17),2.77(1H,q,H-11),2.53～2.43(4H,m,H-23,28),2.40 -2.32(1H,m,H-16),2.26～2.19(1H,m,H-15),1.87(3H,s,H-27),1.82～1.72(2H,m,H-16,15),1.71～1.65(2H,m,H-1),1.29(3H,s,H-21),1.28(3H,s,H-18),1.24(3H,t,H-29),1.10(3H,s,H-19);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:212.5(C-12),205.4(C-6),169.3(C-26),163.2(C-8),157.5(C-24),124.0(C-7),121.8(C-25),90.1(C-14),84.1(C-22),76.1(C-20),68.6(C-2),68.4(C-3),62.2(C-13),51.5(C-5),44.4(C-17),40.5(C-10),37.7(C-1),37.4(C-9),37.2(C-11),32.5(C-4),32.1(C-15),30.9(C-23),28.2(C-28),23.9(C-19),22.0(C-21),21.3(C-16),17.7(C-18),12.2(C-27),11.9(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15,16]報(bào)道一致，故鑒定化合物11為筋骨草內(nèi)酯。

化合物12 黃色油狀物(甲醇)；ESI-MS：m/z352.071 3[M+ Na]+(計(jì)算值為352.072 8)，相對(duì)分子量352，分子式C21H36O4；1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:5.38～5.31(6H,m,H-9′,10′,12′,13′,15′,16′),4.15(1H,dd,J=11.4,4.4 Hz,H-1),4.06(1H,dd,J=11.4,6.3 Hz,H-1),3.82(1H,q,J=5.5 Hz,H-2),3.55(2H,dd,J=5.6,1.8 Hz,H-3),2.81(4H,t,J=5.9 Hz,H-11′,14′),2.35(2H,t,J=7.4 Hz,H-2′),2.09(4H,q,J=7.4,6.9 Hz,H-3′,8′),1.41～1.27(10H,m,H-4′,5′,6′,7′,17′),0.97(3H,t,J=7.5 Hz,H-18′);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:175.7(C-1′),132.9(C-16′),131.2(C-9′),129.4(C-12′),129.4(C-13′),129.0(C-15′),128.4(C-10′),71.3(C-2),66.7(C-1),64.3(C-3),35.1(C-2′),30.8(C-5′),30.4(C-7′),30.3(C-4′,6′),28.30(C-8′),26.7(C-11′),26.6(C-14′),26.1(C-3′),21.6(C-17′),14.8(C-18′ )。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故鑒定化合物12為α-(9′Z,12′Z,15′Z)-octadecatrienoic acid monoglyceride。

5 生物活性測定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7生成的NO細(xì)胞模型對(duì)化合物3、4、7、9、11進(jìn)行了抗炎活性測定，以Bay 11-7085為陽性對(duì)照，測試濃度為50 μM，通過測定化合物對(duì)NO的抑制作用評(píng)價(jià)其抗炎活性。3-磷酸甘油酸脫氫酶(PHGDH)是絲氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。抑制PHGDH活性可以表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述化合物進(jìn)行了PHGDH抑制活性測定，以CBR5884為陽性對(duì)照，測試濃度為25 μM。結(jié)果顯示化合物3、4、7、9、11對(duì)NO抑制率不顯著，沒有明顯的抗炎活性；化合物7對(duì)PHGDH具有一定的抑制作用，其抑制率為23.3%。

6 討論

唇形科筋骨草屬植物在全世界范圍內(nèi)有超過300多種，其藥用歷史悠久，廣泛應(yīng)用于治療發(fā)熱，風(fēng)濕，痛風(fēng)，哮喘，糖尿病等癥。目前，對(duì)于筋骨草屬植物的研究主要集中于金瘡小草，紫背金盤，苞葉筋骨草等品種，關(guān)于美花圓葉筋骨草的化學(xué)成分研究報(bào)道很少。本課題組前期從美花圓葉筋骨草中主要獲得脂溶性成分，如二萜、甾體、黃酮、香豆素等成分，但其極性成分如糖苷類則報(bào)道較少。因此本研究通過優(yōu)化提取分離流程，重點(diǎn)對(duì)其極性成分進(jìn)行研究，從乙酸乙酯部位中共分離鑒定了12個(gè)化合物，化合物1～3、5～7為糖苷類，化合物4、9、11為甾體類，化合物8為環(huán)烯醚萜類，化合物10為酚類，12為長鏈脂肪醇類，其中化合物1～6、8、12為首次從該屬植物中分離得到，化合物1～9、11～12為首次從該種植物中分離得到，進(jìn)一步豐富了本種藥用植物的化學(xué)成分?；衔?、4、7、9、11的抗炎與PHGDH抑制活性研究表明，所篩化合物3、4、7、9、11均無抗炎活性，化合物7對(duì)PHGDH具有抑制作用，其抗腫瘤作用有待進(jìn)一步研究。

本論文在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步豐富了美花圓葉筋骨草的化學(xué)成分類型，為該種藏藥資源的綜合開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)；針對(duì)其抗炎活性和PHGDH抑制活性進(jìn)行了初步篩選，盡管活性結(jié)果不盡如人意，但是對(duì)于此類分子生物活性的后期研究具有一定的參考價(jià)值和指導(dǎo)意義。結(jié)合美花圓葉筋骨草的民間應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)和臨床療效，其抗炎活性值得挖掘研究，然而關(guān)于其抗炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，本研究結(jié)果提示其甾體類成分、糖苷類成分非其抗炎的有效成分，其它成分如二萜等將是我們后期的研究重點(diǎn)。