苦筍化學(xué)成分及其抗炎活性

盧辛甜邵 莉 趙碧清 周小江?

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410208）

苦筍為禾本科植物苦竹Pleioblastus amarus（Keng）keng 的嫩苗，是一種常見(jiàn)的美味菜肴，因?yàn)槠浯嗄埘r美而深受人們的喜愛(ài)，同時(shí)，也是一種中藥材，具有清熱除煩、除濕、利水的功效，主治熱病煩渴、濕熱黃疸、小便不利、腳氣等癥［1-2］。其藥用歷史悠久，明代《本草綱目》 就有記載：“苦筍味苦甘寒，主治不睡、去面目及舌上熱黃，消渴明目，解酒毒、除熱氣、益氣力、利尿、下氣化痰，理風(fēng)熱腳氣，治出汗后傷風(fēng)失音”?？喙S主要含黃酮類、酚酸類、生物堿類、苯環(huán)衍生物及微量元素等成分，具有抗氧化、抗炎、降血糖等作用［1-4］。

苦筍作為食品，人們?yōu)榱似淇诟懈?，常在加工過(guò)程中，倒入沸水中煮，再倒入流動(dòng)水中漂洗24 h 以上，以去除部分苦味［5］，但水提液被舍棄浪費(fèi)了。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)苦筍水提物具有顯著的抗炎作用，且無(wú)不良反應(yīng)，可以制作食品、片劑、膠囊、顆粒劑等［6］。

為了綜合開(kāi)發(fā)利用苦筍這一藥食兩用資源，課題組特對(duì)苦筍水提液的化學(xué)成分和抗炎活性進(jìn)行研究，為苦筍水提液的深層次的開(kāi)發(fā)利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用硅膠、反相硅膠、Sephadex LH-20等多種柱色譜，從苦筍水提液中分離得到11個(gè)化合物，其中，化合物1～4、6～11為首次從該植物中分離得到，化合物2、8為其抗炎活性成分。

1 材料

Bruker DRP-600 MHz 核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker 公司，TMS 為內(nèi)標(biāo)）；Xevo G2-XS QTof 高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；LC-15C 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；Sephadex LH-20型羥丙基葡聚糖凝膠（美國(guó)Amersham Biosciences 公司）；Rp-18反相硅膠（40～63 μm，日本Daiso 公司）；ReproSil 100-C18色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，德國(guó)邁克公司）；柱色譜硅膠（200～300目，青島海洋化工廠）；硅膠H 和薄層色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）；OHAUS CP214型電子分析天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］；D101大孔吸附樹(shù)脂（天津允開(kāi)公司）；DH-160I直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三藤儀器廠）；XDS-100倒置顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）。DMEM培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液（美國(guó)Gibco 公司）；其他試劑均為分析純。

苦筍于2017年5月購(gòu)買(mǎi)于四川省南溪縣，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為禾本科植物苦竹Pleioblastus amarus（Keng）keng 的新鮮嫩苗。

2 提取與分離

新鮮苦筍去殼后取65 kg，加6倍量水煎煮2次，每次0.5 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮，得濃縮液。將濃縮液加于大孔吸附樹(shù)脂柱上，先用水洗脫，棄去水洗脫液，再用95% 乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇并濃縮，得浸膏約48 g。浸膏拌樣，加于正相硅膠柱色譜柱上，石油醚-乙酸乙酯-甲醇（70 ∶30 ∶2～70 ∶30 ∶50）梯度洗脫，收集洗脫液，檢識(shí)，合并成3部分（Fr.1～Fr.3）。

Fr.1（2.40 g）過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，甲醇洗脫，檢識(shí)，合并成7部分（Fr.1-1～Fr.1-7）。Fr.1-3（0.14 g）經(jīng)制備薄層［石油醚-乙酸乙酯（1 ∶1）］為展開(kāi)劑和高效液相色譜［流動(dòng)相為甲醇-水（14 ∶86）］純化，得化合物9（3.6 mg）。Fr.1-4（0.73 g）過(guò)正相硅膠柱色譜［石油醚-乙酸乙酯（20 ∶1～1 ∶2）梯度洗脫］，檢識(shí)，合并成5部分（Fr.1-4-1～Fr.1-4-5）。Fr.1-4-2經(jīng)制備薄層［石油醚-乙酸乙酯（1 ∶1）］為展開(kāi)劑和高效液相色譜 ［流動(dòng)相為甲醇-水（35 ∶65）］純化，得化合物5（2.1 mg）、6（2.4 mg）、7（7.1 mg）、8（2.2 mg）。Fr.1-5先過(guò)正相硅膠柱色譜［三氯甲烷-丙酮（90 ∶1～20 ∶1）梯度洗脫］，檢識(shí)，合并成5部分（Fr.1-5-1～Fr.1-5-5）。Fr.1-5-1經(jīng)高效液相色譜［流動(dòng)相為甲醇-水（10 ∶90）］純化，得化合物10（4.0 mg）。Fr.1-5-2經(jīng)高效液相色譜 ［流動(dòng)相為甲醇-水（15 ∶85）］純化，得化合物11（2.8 mg）。

Fr.2（1.92 g）過(guò)反相C18柱色譜，甲醇-水梯度洗脫，檢識(shí)，合并成3部分（Fr.2-1～Fr.2-3）。Fr.2-1過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，甲醇洗脫，檢識(shí)，合并成4部分（Fr.2-1-1～Fr.2-1-4）。Fr.2-1-2過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，甲醇洗脫，檢識(shí)，合并成2部分（Fr.2-1-2-1～Fr.2-1-2-2），其中Fr.2-1-2-2為化合物1（5.2 mg）。Fr.2-1-2-1先過(guò)正相硅膠柱色譜［石油醚-乙酸乙酯-丙酮（1 ∶1 ∶1）洗脫］，再經(jīng)高效液相色譜［流動(dòng)相為甲醇-水（20 ∶80）］純化，得化合物2（3.5 mg）、3（2 mg）、4（4.6 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無(wú)色晶體，分子式C13H14O6，HRESI-Q-TOF-MSm／z：267.086 1 ［M＋H］＋。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃 色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.06（1H，d，J=9.7 Hz，H-4），6.31（1H，d，J=9.7 Hz，H-3），4.02（3H，s，5-OCH3），3.97（3H，s，7-OCH3），3.93（3H，s，6-OCH3），3.90（3H，s，8-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：162.4（C-2），152.2（C-7），146.7（C-6），145.4（C-5），144.0（C-8），140.6（C-4），138.1（C-9），114.7（C-3），110.9（C-10），62.6（5-OCH3），62.3（7-OCH3），62.2（6-OCH3），61.9（8-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［7］一致，故鑒定為5，6，7，8-四甲氧基香豆素。

化合物2：黃色固體，分子式C14H16N2O3，HR-ESI-Q-TOF-MSm／z：261.126 0 ［M＋H］＋。易溶于甲醇，硫酸-乙醇顯紫棕色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.03（2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′），6.70（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′），4.36（1H，t，J=4.4 Hz，H-3），3.55（1H，m，H-6α），3.35（1H，m，H-6β），4.05（1H，m，H-9），3.08，3.03（2H，dd，J=5.1，14.2 Hz，H-10），2.10（1H，m，H-8α），1.81（2H，m，H-7），1.22（1H，m，H-8β）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：170.7（C-1），167.0（C-4），157.9（C-4′），132.1（C-2′，6′），127.5（C-1′），116.3（C-3′，5′），60.1（C-9），57.9（C-3），46.0（C-6），37.7（C-10），29.4（C-8），22.7（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］一致，故鑒定為環(huán)（脯氨酸-酪氨酸）。

化合物3：白色固體，分子式C10H14N2O5，HR-ESI-Q-TOF-MSm／z：241.079 1 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯紫棕色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.81（1H，s，H-6），6.29（1H，t，J=6.8 Hz，H-1′），4.40（1H，m，H-3′），3.90（1H，m，H-4′），3.79（1H，dd，J=3.1，12.1 Hz，H-5′a），3.73（1H，dd，J=3.6，12.1 Hz，H-5′b），2.21（2H，m，H-2′），1.88（3H，s，5-CH3）；13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：166.6（C-4），152.4（C-2），138.1（C-6），111.5（C-5），88.8（C-1′），86.2（C-4′），72.2（C-3′），62.9（C-5′），41.2（C-2′），12.5（5-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］一致，故鑒定為胸苷。

化合物4：淺黃色固體，分子式C5H6N2O2，HR-ESI-Q-TOF-MSm／z：127.050 3 ［M＋H］＋。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯紫色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.23（1H，s，H-6），1.85（3H，s，5-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：167.7（C-4），154.2（C-2），140.1（C-6），110.3（C-5），12.1（5-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］一致，故鑒定為胸腺嘧啶。

化合物5：白色晶體，分子式C8H10O2，HRESI-Q-TOF-MSm／z：137.059 5 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.03（2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6），6.70（2H，d，J=8.3 Hz，H-3，5），3.68（2H，t，J=7.2 Hz，H-2′），2.71（2H，t，J=7.2 Hz，H-1′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：156.8（C-4），131.0（C-1），130.9（C-2，6），116.1（C-3，5），64.6（C-2′），39.4（C-1′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］一致，故鑒定為對(duì)羥基苯乙醇。

化合物6：白色晶體，分子式C8H8O3，HRESI-Q-TOF-MSm／z：151.038 6 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.06（2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6），6.71（2H，d，J=8.3 Hz，H-3，5），3.52（2H，s，H-1′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：174.6（C-2′），158.0（C-4），131.3（C-2，6），126.1（C-1），116.4（C-3，5），40.9（C-1′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］一致，故鑒定為對(duì)羥基苯乙酸。

化合物7：白色晶體，分子式C9H10O3，HRESI-Q-TOF-MSm／z：165.054 5 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.00（2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6），6.68（2H，d，J=8.3 Hz，H-3，5），2.81（2H，t，J=7.6 Hz，H-1′），2.56（2H，t，J=7.6 Hz，H-2′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：175.3（C-3′），156.9（C-4），132.6（C-1），130.2（C-2，6），116.2（C-3，5），37.1（C-2′），31.2（C-1′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］一致，故鑒定為對(duì)羥基苯丙酸。

化合物8：白色固體，分子式C10H12O4，HRESI-Q-TOF-MSm／z：197.081 3 ［M＋H］＋。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃 色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.78（1H，s，H-2），6.69（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.62（1H，d，J=8.0 Hz，H-6），3.83（3H，s，3-OCH3），2.83（2H，t，J=7.6 Hz，H-1′），2.59（2H，t，J=7.6 Hz，H-2′）；13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：175.4（C-3′），148.9（C-4），146.0（C-3），133.5（C-1），121.7（C-6），116.2（C-5），113.0（C-2），56.3（3-OCH3），37.1（C-2′），31.6（C-1′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］一致，故鑒定為4-羥基-3-甲氧基苯丙酸。

化合物9：無(wú)色固體，分子式C8H10O2，HRESI-Q-TOF-MSm／z：137.059 0 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.38～7.25（5H，m，H-2，3，4，5，6），4.68（1H，dd，J=4.7，7.4 Hz，H-1′），3.61（2H，m，H-2′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：143.3（C-1），129.2（C-3，5），128.5（C-4），127.4（C-2，6），76.0（C-1′），68.7（C-2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］一致，故鑒定為1-苯基-1，2-乙二醇。

化合物10：白色固體，分子式C14H14O3，HRESI-Q-TOF-MSm／z：231.251 2 ［M＋H］＋。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃 色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.75（4H，m，H-2，2′，6，6′），6.65（4H，m，H-3，3′，5，5′），3.35（6H，s，4-OCH3，4′-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：146.3（C-4，4′），146.1（C-1，1′），120.9（C-2，2′，6，6′），116.4（C-3，3′，5，5′），49.8（4-OCH3，4′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］一致，故鑒定為bis（4-methoxyphenenyl）ether。

化合物11：無(wú)色晶體，分子式C13H20O2，HRESI-Q-TOF-MSm／z：207.137 4 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯棕色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.94（1H，d，J=9.9 Hz，H-5），6.14（1H，d，J=9.9 Hz，H-6），3.81（1H，m，H-3′），2.52（1H，m，H-1′a），2.38（1H，m，H-1′b），1.89（3H，s，H-9），1.60（2H，m，H-2′），1.29（3H，s，H-7），1.28（3H，s，H-8），1.22（3H，d，J=6.3 Hz，H-9）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：188.5（C-1），165.5（C-3），160.2（C-5），132.4（C-2），126.1（C-6），68.8（C-3′），42.2（C-4），38.7（C-2′），27.9（C-1′），26.0（C-7），25.9（C-8），23.3（C-4′），11.5（C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］一致，故鑒定為3-（3′-hydroxybutyl）-2，4，4-trimethylcyclohexa-2，5-dienone。

4 抗炎活性篩選

對(duì)分離得到的化合物1～4、7～8進(jìn)行抗炎活性篩選，采用LPS 誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型評(píng)價(jià)化合物抑制NO 產(chǎn)生的活性。

4.1 方法

4.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS＋1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中；以上細(xì)胞2～3 d換1次液，細(xì)胞匯合率達(dá)80% 左右，胰酶消化細(xì)胞，一分為二進(jìn)行細(xì)胞傳代。

4.1.2 細(xì)胞鋪板 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞鋪板，鋪1個(gè)96孔板，共60個(gè)孔，每孔100 μL 細(xì)胞懸液，每孔約1×104個(gè)細(xì)胞。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)液，并進(jìn)行藥物處理。各孔藥物處理分組如下，每組3個(gè)復(fù)孔分別為空白組，只含DMEM 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 h；陰性對(duì)照組，含1 μg／mL LPS 的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h；陽(yáng)性對(duì)照組，阿司匹林濃度分別為25、50、100、200 μmol／L，并含有1 μg／mL LPS 共同處理20 h；6個(gè)加藥組，每個(gè)藥物的質(zhì)量濃度分別為30 μg／mL，并含有1 μg／mL LPS 共同處理20 h。

4.1.3 NO 檢測(cè) 取出Griess Reagent Ⅰ和Ⅱ，使恢復(fù)室溫；用DMEM＋10% FBS 稀釋對(duì)照品（1～100 μg／mL）；對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0、1、2、5、10、20、40、60、100 μg／mL；分別取樣品培養(yǎng)液上清液，按50 μL／孔，在96孔板中加入對(duì)照品及樣品；按50 μL／孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent Ⅰ；按50 μL／孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent Ⅱ；在540 nm 測(cè)定吸光度。

4.2 結(jié)果 化合物2、8在30.0 μg／mL 表現(xiàn)出較弱的NO 抑制作用?；衔?復(fù)孔一、二、三的OD值分別為0.539 6、0.601 3、0.610 9，其平均OD值為0.583 9，其平均抑制率為37.28%?；衔?復(fù)孔一、二、三的OD值分別為0.623 5、0.556 9、0.618 4，其平均OD值為0.599 6，其平均抑制率為36.16%。對(duì)化合物2、8進(jìn)行量效關(guān)系考察，根據(jù)毒性試驗(yàn)結(jié)果確定各化合物濃度梯度，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為98.9、81.9 μmol／L。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)采用硅膠柱、Sephadex LH-20凝膠柱等方法對(duì)苦筍水提液化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離得到11個(gè)化合物，其中，化合物1～4、6～11均為首次從該植物中分離得到。其中，化合物1為香豆素類，藥理研究表明，這類化學(xué)成分多具有抗癌、抗炎、抗凝血及抗菌等活性［18-19］?；衔?～4為生物堿類，這類化合物多具有較好的抗炎作用［20-21］?；衔?～10為芳香族，通過(guò)適當(dāng)處理可作為天然香料，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。化合物11為烯酮類，可通過(guò)合成得到［17］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)部分單體化合物進(jìn)行抗炎活性篩選，確定化合物2、8為苦筍抗炎活性成分，其能較弱地抑制NO 產(chǎn)生，具有較弱的抗炎活性。推測(cè)生物堿和酚酸類可能為苦筍清熱功效成分。以期為苦筍水提液資源價(jià)值發(fā)現(xiàn)，資源循環(huán)利用提供依據(jù)，也為后續(xù)研究苦筍物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制等提供一定的參考。