microRNA-29a在老年2型糖尿病患者血清中的變化及其靶向CDKL2抑制腎癌HEK-293T細(xì)胞增殖

上官同琴

(鄭州市第九人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

糖尿病是一種以高血糖為典型特征的代謝紊亂性疾病。糖尿病分為四大類，即1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、其他特殊類型和妊娠期糖尿病，其中常見的是T2DM，約占糖尿病患者的90%。長期存在的高血糖導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙〔1～4〕。T2DM的特征在于胰島素抵抗和胰島素分泌受損情況下的高血糖。老年T2DM患者胰島素抵抗加重，身體虛弱，各種肌肉老化，器官更易衰竭，獨(dú)立生存能力受到影響，嚴(yán)重影響了生存質(zhì)量〔5〕。MicroRNA(miR)是一類20～24個(gè)核苷酸的高保守內(nèi)源性單鏈小分子非編碼RNA，大部分是通過結(jié)合靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)降解mRNA或抑制其翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，或與相關(guān)蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控，決定了人體多種信號(hào)過程，包括增殖、分化及凋亡等一系列重要生命活動(dòng)的進(jìn)程，是一種重要的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制〔3〕。因此，miR異常表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生發(fā)展。目前，很多研究發(fā)現(xiàn)miR異常表達(dá)與糖尿病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔6～8〕。本研究旨在探索miR-29a在老年T2DM中的表達(dá)及作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 腎癌HEK-293T細(xì)胞系購自上海細(xì)胞研究所，用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2臨床病例 選擇 2014年8月至2016年3月鄭州市第九人民醫(yī)院腎內(nèi)科確診為T2DM的36例患者為研究對(duì)象。男16例，女20例；年齡50～76 歲，平均62.8 歲；40 例健康體檢者為對(duì)照組，男20例，女20例，年齡50～76歲，平均62.0歲。所有血清標(biāo)本-80℃保存。本實(shí)驗(yàn)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3主要試劑和儀器 Trizol LS Reagent、脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000 (美國Invitrogen公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；miR-29a 引物，miR-29a模擬物，miR-29a抑制劑，陰性對(duì)照(廣州銳博生物有限公司)；抗β-actin抗體，抗依賴性激酶2蛋白基因(CDKL2)抗體(美國Santa Cruz公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國全式金生物公司)；SYBR GreenMaster(日本TOYOBO公司)；pmir-Glo載體，雙熒光報(bào)告基因檢測試劑盒(美國promega公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀(美國 ABI 公司)；熒光發(fā)光檢測儀(美國promega公司)。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用常規(guī)轉(zhuǎn)染方法，參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，取對(duì)數(shù)生長期的HEK-293T細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6孔板上培養(yǎng)，待細(xì)胞融合70%～80%時(shí)，用LipofectamineTM2000試劑將miR-29a模擬物及陰性對(duì)照(無關(guān)序列)等轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞。

1.5qRT-PCR 利用Trizol LS Reagent提取血清中總RNA，然后用特異的miR-29a反轉(zhuǎn)引物將200 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后利用染料法qRT-PCR，檢測血清中miR-29a及內(nèi)參U6的含量。反應(yīng)條件： 95℃ 10 min預(yù)變性； 95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。 miR-29a的相對(duì)表達(dá)量以 2-△△CT法計(jì)算。

1.6免疫蛋白印跡法 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h提取總蛋白質(zhì)，二喹啉甲酸法(BCA)定量后與蛋白上樣緩沖液混勻，100℃煮10 min，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(NC)膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，第二天三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)-吐溫(T)洗滌3～5次，每次10 min，之后加入二抗，室溫孵育1 h，TBS-T洗滌3～5次，每次10 min，之后進(jìn)行顯影，定影。

1.7雙熒光報(bào)告系統(tǒng) 利用野生型CDKL2(3′-UTR上游引物：5′-CTAGCTAGCTTATGAGACTCTGGCCTCCCT-3′；下游引物：5′-ACGCGTCGACGGAGACAGGAACTTCTCTGG-3′)將CDKL2 3′-UTR的部分序列克隆到pmir-Glo載體螢火蟲熒光素酶基因的下游(CDKL2-pmir-Glo)。利用突變引物(突變型CDKL2 3′-UTR上游引物：5′-CCATGTATTGTAAGATTCTAGAGATGATGCTCCATA-3′；下游引物：5′-CATCTCTAGAATCTTACAATACATGGAACTAACCAA-3′)和點(diǎn)突變試劑盒將CDKL2 3′-UTR中的miR-29a結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變(CDKL2-pmir-Glo-mut)。共轉(zhuǎn)染CDKL2-pmir-Glo和miR-29a的模擬物、抑制劑和相應(yīng)的陰性對(duì)照組及共轉(zhuǎn)染點(diǎn)突變后的CDKL2-pmir-Glo-mut和miR-29a的模擬物和陰性對(duì)照組。將HEK-293T細(xì)胞接種在48孔板貼壁后按各處理組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后收獲細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶測定。結(jié)果表示為相對(duì)熒光素酶活性〔螢火蟲熒光素酶熒光強(qiáng)度(LUC)/海腎LUC〕，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.8噻唑藍(lán)(MTT)檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h的HEK-293T細(xì)胞以3×103個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積100 μl，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔(只加培養(yǎng)基)，分別轉(zhuǎn)染mir-29a的模擬物和抑制劑，24 h后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，至終濃度為1 mg/ml，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，37℃震蕩10 min，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解，以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀562 nm測定各孔吸光度值(OD值)表示細(xì)胞增殖能力。每組取5孔平均值繪制增殖曲線，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-29a在T2DM患者血清中低表達(dá) 相比于正常對(duì)照組miR-29a(3.6±1.4)，T2DM患者血清中miR-29a含量(2.5±1.3)明顯降低(P<0.05)。

2.2雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-29a對(duì)CDKL2的靶向作用 與陰性對(duì)照組(3.94±0.18)相比，miR-29a模擬物轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性(1.97±0.43)顯著抑制(P<0.05)，與抑制劑對(duì)照組(3.71±0.15)相比，miR-29a抑制劑的熒光素酶活性(4.77±0.16)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。與CDKL2-pmir-Glo-mut(3.92±0.12)相比，miR-29a模擬物和CDKL2-pmir-Glo共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的酶活性(2.08±0.31)顯著降低(P<0.05)。miR-29a模擬物能明顯抑制CDKL2蛋白表達(dá)，mir-29a抑制劑能夠促進(jìn)CDKL2蛋白表達(dá)。見圖1。

2.3miR-29a抑制心肌細(xì)胞增殖 miR-29a模擬物轉(zhuǎn)染組(0.34±0.04)與陰性對(duì)照組(0.54±0.02)相比吸光度值明顯降低(P<0.01)；與抑制劑對(duì)照組(0.53±0.04)相比，miR-29a抑制劑轉(zhuǎn)染組(0.63±0.03)的吸光度值顯著提高(P<0.05)。

圖1 雙熒光報(bào)告驗(yàn)證miR-29a對(duì)CDKL2的靶向作用

3 討 論

目前，T2DM的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，治療方法不成熟〔9〕。作為一項(xiàng)新技術(shù)新方法，深入研究miR的功能及作用機(jī)制，有望找到糖尿病治療的新靶點(diǎn)、新方法，并且能提高老年人生活質(zhì)量，減少養(yǎng)老負(fù)擔(dān)。很多研究報(bào)道了和糖尿病相關(guān)的miR，如在糖尿病大鼠模型中，miR-27b表達(dá)量顯著增加；同時(shí)大鼠血糖水平與miR20b的RNA水平存在負(fù)相關(guān)；對(duì)T2DM患者而言，miR-27b可能通過促進(jìn)腎臟炎癥、纖維化等作用來損傷腎臟組織,導(dǎo)致腎功能損害的發(fā)生〔10～12〕。miR-29a在成熟組織中表達(dá)，尤其是心臟、腎臟和肺組織中表達(dá)明顯。miR-29a對(duì)葡萄糖的攝入和吸收及體內(nèi)葡萄糖的平衡有重要作用〔13〕。研究報(bào)道促炎性細(xì)胞因子處理的大鼠胰島β細(xì)胞中miR-29a/b表達(dá)量顯著上調(diào)，細(xì)胞凋亡率上調(diào)，推測促炎性細(xì)胞因子可能通過調(diào)節(jié)miR-29表達(dá)影響細(xì)胞凋亡功能，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引發(fā)糖尿病〔14〕。對(duì)miR-29a功能研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a對(duì)HEK-293有明顯的抑制增殖作用。糖尿病病變一般累及腎臟，主要會(huì)導(dǎo)致腎小球和腎小管肥大、基膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)堆積，這些與細(xì)胞的增殖相關(guān)〔12,15,16〕。在糖尿病患者血清中，miR-29a表達(dá)明顯降低，可能會(huì)引發(fā)腎臟多種細(xì)胞過度增殖，從而引起細(xì)胞堆積和基底膜增厚等腎臟疾病，甚至導(dǎo)致腎功能異常。本研究說明miR-29a異常表達(dá)可能與T2DM及其并發(fā)癥有一定關(guān)系，這兩者之間的關(guān)系有待更深層次的探討。在miR的研究中，通過miRBase在線工具分析miR-29a序列。應(yīng)用TargetScan及miRNAda兩種計(jì)算方法預(yù)測miR-29a靶基因，并用熒光素酶報(bào)告技術(shù)來驗(yàn)證miRNA的靶基因〔17,18〕。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的原理是以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。pmir-Glo報(bào)告載體同時(shí)含有螢火蟲和海腎熒光素酶基因，可以簡單、快捷、靈敏地得出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)〔19〕。本文提示miR-29a可能結(jié)合CDKL2的3′-UTR并抑制其表達(dá)和翻譯，從而影響其活性，Western結(jié)果提示細(xì)胞內(nèi)miR-29a表達(dá)水平發(fā)生改變時(shí)內(nèi)源性CDKL2蛋白表達(dá)水平也會(huì)隨之受到影響。對(duì)CDKL2與miR-29a結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變以影響兩者結(jié)合，結(jié)果提示點(diǎn)突變后miR-29a與CDKL2的3′-UTR結(jié)合受到影響，不能抑制CDKL2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，也進(jìn)一步確認(rèn)了CDKL2的3′-UTR與miR-29a靶向關(guān)系。研究報(bào)道，CDKL家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超家族，這類蛋白在細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)發(fā)育等生物學(xué)進(jìn)程中起到重要調(diào)控作用〔20〕。推測可能miR-29a靶向CDKL2之后調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制細(xì)胞增殖。

綜上，在T2DM患者血清中，miR-29a表達(dá)量明顯下調(diào)，CDKL2為miR-29a的作用靶點(diǎn)，miR-29a能明顯抑制HEK-293T細(xì)胞的增殖，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。