miR-124靶向調(diào)控STAT3調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化中血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性

謝民 李社芳 邢海燕 謝翀

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，河南 鄭州 450004；2第一附屬醫(yī)院腦病中心；3第一附屬醫(yī)院腎病科；4河南省實(shí)驗(yàn)中學(xué))

內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用〔1〕。然而，內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)凋亡的分子機(jī)制尚不清楚。載脂蛋白(Apo)E是AS的有效抑制劑，高膽固醇飲食可導(dǎo)致ApoE表達(dá)缺失的小鼠慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)〔2,3〕。微小RNA(miRNA)是小的非編碼RNA，通過(guò)與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)而轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白表達(dá)〔4〕。大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)多種靶標(biāo)或信號(hào)途徑在AS發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔5～7〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，在同型半胱氨酸(Hcy)致AS中miRNA-124(miR-124)表達(dá)下調(diào)，其中機(jī)制可能與miR-124啟動(dòng)子區(qū)高甲基化改變有關(guān)〔8〕。然而，miR-124在AS中的作用機(jī)制仍未闡明。本研究擬探討miR-124 在AS中的作用及潛在分子機(jī)制，為防治AS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 體重28～32 g，6周齡，C57BL/6J背景的雄性ApoE-/-小鼠，購(gòu)自中國(guó)北京華阜康生物科技股份有限公司。miRNA mimic陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-124 mimic購(gòu)自中國(guó)上海吉瑪；4%多聚甲醛、最佳切割溫度復(fù)合物(OCT)包埋劑、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、油紅O染色試劑盒、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs)購(gòu)于美國(guó)ATCC公司；胎牛血清、青霉素/鏈霉素、Lipofectamine 2000、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；含生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司；miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒及miR-124和U6引物均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PE-cy7-Pecam-1抗體和FITC-Annexin V Apoptosis Detection Kit I均購(gòu)自美國(guó)BD公司；pmirGLO質(zhì)粒、Dual Luciferase?Reporter Assay System購(gòu)自Promega公司；Pecam-1、Vimentin、α-SMA、Bax、Bcl-2、STAT3、β-actin抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)二抗和電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore公司。

1.2動(dòng)物模型構(gòu)建 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南進(jìn)行。小鼠飼養(yǎng)于無(wú)特殊病原體的微隔離籠中，溫度24℃、濕度(40±50)%、明暗交替各12 h。將12只小鼠隨機(jī)分為正常飲食(ND)組和高脂飲食(HFD)組，HFD組ApoE-/-小鼠給予HFD(10%豬油、10%膽固醇、2%膽酸鹽和78%基礎(chǔ)飼料)12 w，以形成可見(jiàn)的AS模型；以喂食基礎(chǔ)飼料的ND組小鼠為對(duì)照。另外，在HFD處理前，ApoE-/-小鼠通過(guò)尾靜脈注射過(guò)表達(dá)miR-124 的mimics或miR-NC。第12周末，處死小鼠并將分離的主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇保存在液氮中備用。

1.3AS病變檢測(cè) 將取出的小鼠主動(dòng)脈弓用4%多聚甲醛固定6 h，30%蔗糖冷凍24 h，OCT包埋并切片，厚度約6 μm。通過(guò)HE染色和油紅O染色于顯微鏡下觀察AS損傷。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將HAECs用含5%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和添加生長(zhǎng)因子的ECM于37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化，取1×105個(gè)接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后融合度達(dá)50%時(shí)，用Lipofectamine 2000試劑將miR-124和miR-NC瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HAECs，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞用于噻唑藍(lán)(MTT)、流式細(xì)胞術(shù)或蛋白質(zhì)、miRNA檢測(cè)。

1.5ox-LDL處理細(xì)胞 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后1 d，用100 μg/ml的ox-LDL處理HAECs，然后收集細(xì)胞進(jìn)行MTT、流式細(xì)胞術(shù)或蛋白質(zhì)、miRNA檢測(cè)。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測(cè)miR-124表達(dá) 提取各組小鼠主動(dòng)脈總miRNA及1.5中細(xì)胞總miRNA，按 miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)，37℃、60 min將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用qPCR檢測(cè)miR-124表達(dá)。qPCR反應(yīng)條件：94℃、5 min；40個(gè)循環(huán)：94℃、30 s，62℃、30 s，72℃、30 s。利用2-ΔΔCt計(jì)算miR-124相對(duì)表達(dá)量。

1.7MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取1.5細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔接種3 000個(gè)/100 μl的細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后以此為0 h，分別利用MTT檢測(cè)0、24、48、72 h各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 提取各組小鼠主動(dòng)脈，利用PE-cy7-Pecam-1抗體分離Pecam-1陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞，另取1.5中的處理細(xì)胞，以1×106個(gè)/ml濃度重懸于磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌2次，按照FITC-Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.9Western印跡檢測(cè) 取分離組織或處理后的細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白樣品，并將分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用相應(yīng)的一抗稀釋液及辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗分別進(jìn)行孵育，ECL發(fā)光液在曝光儀上對(duì)蛋白條帶進(jìn)行曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 用Trizol提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用STAT3的3′UTR特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并克隆至pmirGLO報(bào)告載體中構(gòu)建pmirGLO-STAT3(WT)載體，利用Takara點(diǎn)突變?cè)噭┖型蛔僷mirGLO-STAT3(WT)上miR-124結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建pmirGLO-STAT3(Mut)載體。利用Lipofectamine 2000將報(bào)告載體、miR-NC或miR-124轉(zhuǎn)染至HAECs中，48 h后使用Dual Luciferase?Reporter Assay System試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1小鼠AS模型中miR-124低表達(dá) 與ND組相比，HFD組HE染色顯示主動(dòng)脈損傷面積顯著增加〔(7.10±0.60)%，(18.60±1.50)%〕，而且油紅O染色顯示主動(dòng)脈竇損傷面積也顯著增加〔(7.60±0.70)%，(28.00±2.10)%〕。隨后分離主動(dòng)脈弓檢測(cè)其中內(nèi)皮標(biāo)記物Pecam-1和間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、Vimentin表達(dá)水平。與ND組相比，HFD主動(dòng)脈弓中Pecam-1蛋白表達(dá)顯著降低(1.00±0.09，0.28±0.02)，而α-SMA和Vimentin表達(dá)顯著升高(1.00±0.10，3.00±0.30；1.00±0.09，2.80±0.25)。上述結(jié)果表明在ApoE-/-小鼠中HFD成功誘導(dǎo)了AS模型。HFD組miR-124表達(dá)較ND組顯著降低(1.00±0.09，0.31±0.03)；HFD+miR-124組與HFD組相比，主動(dòng)脈弓中miR-124表達(dá)顯著增加(0.31±0.03，0.82±0.08)，同時(shí)主動(dòng)脈損傷面積〔(9.60±0.90)%〕、主動(dòng)脈竇損傷面積〔(15.30±1.20)%〕、主動(dòng)脈弓中α-SMA和Vimentin表達(dá)均顯著降低(3.00±0.30，1.68±0.16；2.80±0.25，1.36±0.12)，而主動(dòng)脈弓中Pecam-1顯著增加(0.65±0.05)。結(jié)果表明在HFD誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AS模型中miR-124低表達(dá)，其過(guò)表達(dá)能夠改善HFD誘導(dǎo)的AS損傷。見(jiàn)圖1。

2.2HFD小鼠Pecam-1陽(yáng)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞凋亡變化及Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與ND組相比，HFD組Pecam-1陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡顯著增加，且促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)；HFD+miR-124組較HFD組Bax表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著增加。見(jiàn)圖2。

2.3miR-124對(duì)ox-LDL處理的HAECs增殖凋亡的影響 與對(duì)照組相比，ox-LDL組miR-124表達(dá)顯著降低，同時(shí)細(xì)胞增殖能力顯著降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)；ox-LDL+miR-124組較ox-LDL+miR-NC組miR-124表達(dá)顯著增加，細(xì)胞增殖能力恢復(fù)，細(xì)胞凋亡顯著降低，Bax表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)，見(jiàn)表1，圖3，圖4。

圖1 各組Vimentin、α-SMA、Pecam-1表達(dá)水平

圖2 Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

表1 各組細(xì)胞相對(duì)吸光度值

與對(duì)照組相比:1)P<0.05；與ox-LDL+miR-NC組相比:2)P<0.05

圖3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖變化

2.4miR-124靶向調(diào)控STAT3表達(dá) 為研究miR-124的作用機(jī)制，本研究利用TargetScan預(yù)測(cè)miR-34a的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STAT3 mRNA的3′UTR中含有與miR-124互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖5)，與miR-NC組相比，miR-124與pmirGLO-STAT3-WT共轉(zhuǎn)后熒光素酶活性顯著降低(1.00±0.09，0.25±0.05)，而miR-124與pmirGLO-STAT3-Mut共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性無(wú)明顯變化(1.00±0.09，0.96±0.09)。Western印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可刺激HAECs中STAT3表達(dá)顯著增加(1.00±0.10，2.50±0.20)，而在HAECs中過(guò)表達(dá)miR-124較miR-NC相比，細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)顯著降低(1.00±0.10,0.34±0.03)。上述結(jié)果表明，在HAECs細(xì)胞中STAT3是miR-124的作用靶標(biāo)，miR-124可能通過(guò)調(diào)控STAT3在AS中發(fā)揮作用。見(jiàn)圖6，圖7。

圖4 Western印跡檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

圖5 miR-124與STAT3 mRNA的3′UTR互補(bǔ)結(jié)合示意圖

圖6 ox-LDL處理的HAECs中STAT3蛋白表達(dá)

圖7 過(guò)表達(dá)miR-124的HAECs中STAT3蛋白表達(dá)

3 討 論

AS是動(dòng)脈壁的一種慢性炎癥性疾病，在血管穩(wěn)態(tài)期間，內(nèi)皮素有助于血管舒張，抑制平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)，并抑制異常炎癥反應(yīng)；而在病理?xiàng)l件下，ECs凋亡可通過(guò)誘導(dǎo)新生內(nèi)膜形成、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、脂質(zhì)運(yùn)輸和斑塊破裂等在AS的發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔9～11〕。大量研究發(fā)現(xiàn)，在血管壁結(jié)構(gòu)改變之前存在ECs功能障礙和損傷，并且許多AS危險(xiǎn)因素包括一氧化氮生成或活性增加及氧化應(yīng)激降低等均被證實(shí)可誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，ECs功能障礙被認(rèn)為是AS的早期特征〔12〕。ApoE是AS的有效抑制劑，多年來(lái)，ApoE表達(dá)缺失的小鼠常被用于構(gòu)建AS模型〔2，3〕。HFD小鼠主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇損傷面積均顯著增加，且ECs開(kāi)始表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)記物Vimentin、α-SMA，發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔13〕。然后，Western印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，來(lái)自HFD小鼠的Pecam-1陽(yáng)性ECs中促凋亡蛋白Bax表達(dá)均顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)被顯著抑制，這與先前研究報(bào)道一致〔14〕。

miRNA是高度保守的小非編碼RNA家族，越來(lái)越多證據(jù)表明，miRNA幾乎參與了所有的生理和病理過(guò)程〔15〕。先前研究表明，miRNA在血管完整性、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖和膽固醇代謝中具有重要作用，這些機(jī)制對(duì)AS和其他心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要〔16～18〕。最近有報(bào)道稱(chēng)，miRNA在AS中可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞存活或死亡發(fā)揮作用。例如，miR-26a被發(fā)現(xiàn)是一種新型抗凋亡miRNA，可直接靶向血管ECs中的TRPC6抑制AS中的ECs凋亡〔10〕。此外，AS中高表達(dá)的miR-429可通過(guò)靶向結(jié)合并抑制Bcl-2 mRNA的翻譯，導(dǎo)致ECs中Bcl-2表達(dá)下調(diào)、凋亡增加〔17〕。然而，miR-124在AS中的作用機(jī)制仍未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)HFD小鼠主動(dòng)脈中miR-124顯著降低，這與先前研究結(jié)果一致〔8〕，其中機(jī)制可能是AS中miR-124啟動(dòng)子區(qū)呈高度甲基化狀態(tài)。此外，本研究通過(guò)miR-124聯(lián)合HFD處理小鼠發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-124可緩解小鼠AS損傷。

ox-LDL是一種重要的AS危險(xiǎn)因素，對(duì)AS的發(fā)生和發(fā)展起重要作用〔19〕。ox-LDL可誘導(dǎo)ECs黏附分子表達(dá)，減少衍生的松弛因子合成，進(jìn)而誘導(dǎo)AS發(fā)生〔20〕。ox-LDL能夠通過(guò)降低抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)ECs凋亡〔21〕。本研究結(jié)果表明ox-LDL可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著降低，而過(guò)表達(dá)miR-124聯(lián)合ox-LDL處理細(xì)胞后，ox-LDL對(duì)HAECs凋亡誘導(dǎo)作用被顯著抑制，進(jìn)一步證實(shí)miR-124可緩解小鼠AS損傷。眾所周知，miRNA通過(guò)抑制靶mRNA的表達(dá)來(lái)發(fā)揮功能。本研究利用TargetScan在線(xiàn)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-124的潛在靶標(biāo)，結(jié)果表明，STAT3是miR-124的靶標(biāo)并且miR-124可抑制STAT3的表達(dá)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理的AS細(xì)胞模型中STAT3表達(dá)增加，提示在AS中低表達(dá)的miR-124 可能通過(guò)STAT3參與ECs功能損傷?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)了miR-124在調(diào)節(jié)AS中ECs凋亡的機(jī)制，并為AS創(chuàng)新療法的發(fā)展提供了新的思路。