左旋氨氯地平對高鈣、高磷誘導(dǎo)的體外血管平滑肌細(xì)胞鈣化的保護(hù)作用

肖云 何淑怡 聶雙玉 張智偉 肖潔 吳峻

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1腎內(nèi)科，廣東 廣州 510120；2心血管內(nèi)科)

血管鈣化是心血管疾病(CVD)中的獨立危險因素，它是慢性腎臟病(CKD)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。隨著患者腎功能下降，其血管鈣化發(fā)生率逐漸增加，鈣化程度加重，死亡風(fēng)險亦明顯增高〔1〕。終末期腎病(ESRD)患者中，血管鈣化極為常見，有70%～90%的ESRD透析患者存在冠狀動脈的鈣化〔2〕。血管鈣化常表現(xiàn)為平滑肌細(xì)胞向軟骨或成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在這一過程中，高磷和高鈣血癥的作用極為突出。骨橋蛋白(OPN)是鈣化血管中的骨基質(zhì)蛋白，是參與抑制血管鈣化的一個重要分子。研究發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)中鈣離子通道參與了血管鈣化的過程，抑制鈣離子通道可減少血管壁鈣的內(nèi)流和沉積，具有保護(hù)血管的作用〔3〕。已經(jīng)有研究提示二氫吡啶類的硝苯地平可延緩高血壓患者的冠狀動脈鈣化〔4〕；還有學(xué)者在血管鈣化模型大鼠中應(yīng)用維拉帕米，結(jié)果發(fā)現(xiàn)維拉帕米可能通過抑制鈣離子內(nèi)流，同時抑制VSMCs內(nèi)sMad1、Runx2基因表達(dá)，從而改善VSMCs的鈣化〔5〕。目前臨床針對 ESRD血管鈣化尚無公認(rèn)有效的治療方案，但積極預(yù)防有助于延緩疾病進(jìn)展。本實驗用高磷、高鈣誘導(dǎo)VSMCs建立體外血管鈣化模型，并采用左旋氨氯地平進(jìn)行干預(yù)，探討鈣離子拮抗劑左旋氨氯地平對高鈣、高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化的保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1實驗試劑及儀器 人主動脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs購自美國ATCC公司)，10%胎牛血清(購自美國Hyclone 公司)、DMEM培養(yǎng)液，青霉素-鏈霉素(購自美國Gibco 公司)，RNA提取試劑盒(購自美國Invitrogen 公司)，PCR引物(由上海生工公司合成)，抗β-actin和抗OPN(購自美國Santa Cruz公司)，SYBR Premix EX Taq試劑盒(購自日本TaKaRa公司)，7900熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，左旋氨氯地平片由美國Pfizer公司提供。

1.2HASMCs培養(yǎng) 將實驗所用的HASMCs加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每1～2天換液1次。

1.3HASMCs鈣化的誘導(dǎo)及標(biāo)本留取 將HASMCs接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞約80%融合后分別改用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)：磷濃度為2.5 mmol/L的培養(yǎng)基(高磷組)，鈣濃度為2.8 mmol/L的培養(yǎng)基(高鈣組)，左旋氨氯地平濃度為10 mg·kg-1·d-1的培養(yǎng)基(左旋氨氯地平組)，磷2.5 mmol/L+左旋氨氯地平的培養(yǎng)基(高磷+左旋氨氯地平組)，鈣2.8 mmol/L+左旋氨氯地平的培養(yǎng)基(高鈣+左旋氨氯地平組)，磷1.4 mmol/L、鈣2.0 mmol/L濃度的培養(yǎng)基(對照組)。培養(yǎng)基培養(yǎng)0、2、4、6、8 d，收集各組細(xì)胞檢測細(xì)胞內(nèi)鈣含量；培養(yǎng)第4、8天收集細(xì)胞提取RNA待做Real-time PCR；培養(yǎng)第8天收集細(xì)胞提取蛋白待做Western印跡。換用培養(yǎng)基的第1天定義為0 d。

1.4細(xì)胞內(nèi)鈣含量的測定 鈣含量的測定根據(jù)Wada等的方法進(jìn)行。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞3次，每孔再加用0.6 mol/L的鹽酸，在37℃條件下脫鈣24 h。吸取上清液，用全自動生化分析儀比色法測定鹽酸懸液中的鈣含量(mmol/L)。脫鈣后的細(xì)胞再用PBS洗滌3次，加入0.1 mol/L的NaOH/0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解細(xì)胞30 min，提取蛋白后用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質(zhì)含量。用蛋白含量標(biāo)化鈣含量(μg/mg蛋白)。

1.5用Real-time PCR檢測OPN mRNA表達(dá) 用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，在10 μl反應(yīng)體系中行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系，按下列公式計算目的基因相對表達(dá)量：目的基因相對表達(dá)量=2-△△CT(△CT=CT目的基因-CT內(nèi)參照；△△CT=△CT各樣本-△CT正常樣本)。各基因引物分別為：OPN正義鏈5′-GCCGACCAAGGAAAACTCACT-3′,反義鏈5′-GGCACAGGTGATGCCTAGGA-3′；β-actin正義鏈5′-TAAAGACGTTGACATCCGCC-3′,反義鏈5′-GGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。

1.6用Western印跡的方法檢測OPN蛋白表達(dá) 收集各實驗組第8天細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液RIPA裂解細(xì)胞后取上清液，煮沸5 min，使蛋白變性；用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量；取40 μg蛋白加入等體積緩沖液中，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗、二抗，全自動顯影機(jī)顯影后采用Band Scan圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1左旋氨氯地平對高鈣、高磷誘導(dǎo)的HASMCs鈣沉積的影響 對照組、左旋氨氯地平組各時間點鈣含量無顯著差異(P>0.05)，高鈣組和高磷組的鈣含量自干預(yù)第2天開始升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨著干預(yù)時間延長，鈣含量進(jìn)一步升高，第6天開始顯著高于對照組(P<0.01)，同時間點高鈣+左旋氨氯地平組和高磷+左旋氨氯地平組與單純高鈣或高磷組相比，細(xì)胞內(nèi)鈣含量明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組細(xì)胞內(nèi)鈣含量的檢測蛋白，n=3)

與同組第0天比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與對照組同時點比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與高鈣組同時點比較：5)P<0.05；與高磷組同時點比較：6)P<0.05

2.2左旋氨氯地平對高鈣、高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)的影響 與同一時間點對照組相比，高鈣組、高磷組的OPN mRNA表達(dá)水平明顯增高，第8天時增加最為明顯(P<0.01)；與高鈣組對比，高鈣+左旋氨氯地平干預(yù)組培養(yǎng)第8天時OPN mRNA水平明顯下降(P<0.01)，與高磷組對比，高磷+左旋氨氯地平干預(yù)后OPN mRNA表達(dá)亦明顯降低，干預(yù)第8天降低最為明顯(P<0.01)。見表2。

2.3左旋氨氯地平對高鈣、高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，高鈣或高磷培養(yǎng)第8天時，OPN蛋白表達(dá)水平較對照組均明顯增高(P<0.01)；在高鈣或高磷培養(yǎng)液中同時加入左旋氨氯地平共同培養(yǎng)8 d，與高鈣或高磷組相比，OPN蛋白水平均明顯下降(P<0.01)。見圖1。

表2 不同時間點各組細(xì)胞內(nèi)OPN mRNA相對值

與同時間點對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與高鈣組比較：3)P<0.01；與高磷組比較：4)P<0.01

1～6:對照組,高鈣組,高鱗組,左旋氨氯地平組,高鈣+左旋氨氯地平組,高鱗+左旋氨氯地平組圖1 各組細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)

3 討 論

血管鈣化是心血管系統(tǒng)中發(fā)生的異常礦化，以磷酸鈣鹽沉積為主，是發(fā)生CVD的獨立危險因素之一。與普通人相比，CKD患者更容易出現(xiàn)血管鈣化，其心血管事件死亡率也明顯升高。有研究表明〔6〕，40%～70%ESRD患者存在明顯冠狀動脈疾病，血管鈣化增加ESRD患者的心血管事件，常常導(dǎo)致心功能不全、急性冠脈綜合征等嚴(yán)重后果。目前ESRD患者血管鈣化的確切機(jī)制尚未完全闡明，除了與傳統(tǒng)因素相關(guān)外，還可能與氧化應(yīng)激、內(nèi)分泌異常、促成骨因子的激活、血管鈣化抑制因子的缺乏、礦物質(zhì)代謝異常、骨代謝異常等有關(guān)〔7〕。已有很多研究表明高鈣、高磷在血管鈣化發(fā)生機(jī)制中的占有重要地位，而ESRD患者中普遍存在著鈣和磷的代謝失常，最終導(dǎo)致血管鈣化。高鈣和高磷如何引起血管鈣化，目前對其作用機(jī)制尚未明確，最近研究發(fā)現(xiàn)，高血鈣和血磷對促進(jìn)血管鈣化具有直接作用〔8〕，包括刺激骨或軟骨的分化、囊泡的釋放、細(xì)胞凋亡、抑制因子的消耗、細(xì)胞外基質(zhì)的降解。高磷血癥主要促進(jìn)VSMCs向骨和軟骨的分化，合成更多加快動脈鈣化的蛋白，而高鈣血癥主要通過誘導(dǎo)VSMCs的凋亡和基質(zhì)小泡的釋放，促進(jìn)VSMCs的骨化，高鈣和高磷對刺激血管鈣化具有協(xié)同作用。本文選用體外培養(yǎng)的人VSMCs，在高鈣、高磷的誘導(dǎo)下建立體外血管鈣化模型。誘導(dǎo)2 d后，細(xì)胞的鈣沉積明顯升高提示建模成功。已有學(xué)者研究硝苯地平對血管鈣化的作用，Motro等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，硝苯地平控釋片可明顯減少冠狀動脈的鈣化，抑制冠狀動脈的粥樣硬化的發(fā)展。Chen等〔9〕在牛VSMCs培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，維拉帕米可以減少VSMCs發(fā)生礦化作用，而硝苯地平作用并不明顯，并提示可能是通過降低堿性磷酸酶活性和基質(zhì)小泡的釋放起抑制血管鈣化作用。鈣拮抗劑可能是通過抑制VSMC增殖和遷移、減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子的超負(fù)荷、抑制血管壁的鈣內(nèi)流及沉積、增加低密度脂蛋白(LDL)的清除和降解、抑制LDL的氧化、抑制血小板激活及保護(hù)內(nèi)皮功能等而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。左旋氨氯地平是二氫吡啶類鈣拮抗劑，在Sievers等〔10〕研究中顯示，與對照組相比，氨氯地平能明顯延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。而本實驗中，合用左旋氨氯地平的高鈣組和高磷組在第6天開始HASMCs鈣沉積均明顯下降，且在第8天時下調(diào)了OPN基因和蛋白的表達(dá)。可見，左旋氨氯地平具有抑制VSMCs鈣化的作用，并與OPN的調(diào)節(jié)相關(guān)，本文推測左旋氨氯地平通過影響OPN的表達(dá)而參與血管鈣化的形成。

OPN是血管鈣化的重要抑制因子，是非膠原骨基質(zhì)蛋白的一種，在機(jī)體正常的情況下，OPN在巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中很少表達(dá)，近年來，學(xué)者發(fā)現(xiàn)ESRD患者血管鈣化周圍有OPN的表達(dá)。在體外的成骨細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)隨著礦化的進(jìn)行，OPN mRNA的表達(dá)水平逐漸升高，OPN隨著骨礦化不同階段的改變而變化〔11〕。Paloian等〔12〕敲除高磷飲食環(huán)境中大鼠的OPN基因，研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，缺乏OPN基因的大鼠更容易導(dǎo)致腎小管及間質(zhì)的鈣沉積和血管鈣化。本研究觀察到體外培養(yǎng)的高磷、高鈣濃度培養(yǎng)基中HASMCs的OPN mRNA及OPN蛋白表達(dá)均明顯增加，且高鈣組的OPN mRNA表達(dá)比高磷組早。左旋氨氯地平干預(yù)后HASMCs的OPN mRNA表達(dá)均明顯下降，且第8天所測OPN蛋白表達(dá)量對比高磷組和高鈣組也明顯下調(diào)，實驗表明，高鈣、高磷誘導(dǎo)HASMCs鈣化的同時促進(jìn)OPN的表達(dá)。而使用左旋氨氯地平干預(yù)后能下調(diào)OPN mRNA和蛋白的表達(dá)，提示左旋氨氯地平降低HASMCs的鈣沉積可能是通過下調(diào)OPN的表達(dá)起作用。OPN 如何發(fā)揮抑制血管鈣化的作用尚不明確，推測可能是OPN通過抑制礦化組織中磷灰石結(jié)晶的生長而減緩鈣化的進(jìn)程，而且使已經(jīng)發(fā)生鈣化部位的礦物質(zhì)溶解，促進(jìn)鈣結(jié)晶的重吸收。

綜上，高鈣、高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化，增加細(xì)胞OPN mRNA和蛋白的表達(dá)；左旋氨氯地平能夠降低高鈣、高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化，減少細(xì)胞OPN mRNA和蛋白的表達(dá)，提示左旋氨氯地平參與了血管鈣化的保護(hù)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)OPN表達(dá)有關(guān)。