骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷模型大鼠Toll樣受體4表達(dá)的影響

李季 蔡錦芳 鄒林 李宗玉

(1鄭州市第一人民醫(yī)院骨外科，河南 鄭州 450004；2濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院骨外科)

脊髓損傷(SCI)是指因各種原因?qū)е录顾枋軗p，在損傷部位及其以下節(jié)段出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)、感覺功能障礙等一系列病理變化，是一種致殘率高、后果嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷〔1〕。治療重點(diǎn)在于最大程度減少繼發(fā)性損傷，挽救已經(jīng)受損的脊髓神經(jīng)元，同時(shí)積極評(píng)價(jià)損傷程度，促進(jìn)損傷后的神經(jīng)修復(fù)和再生，以達(dá)到受損脊髓的結(jié)構(gòu)、功能重建〔2〕?，F(xiàn)有研究對(duì)于SCI的治療主要集中于早期的手術(shù)干預(yù)、藥物治療及疾病后期的功能鍛煉等方面，但均療效不穩(wěn)定，且術(shù)后并發(fā)癥較多，患者常處于截癱狀態(tài)〔3〕。因此，促進(jìn)SCI后功能恢復(fù)是目前研究的熱點(diǎn)。Toll樣受體(TLR)4是TLR超家族受體中最早被發(fā)現(xiàn)的受體之一，研究發(fā)現(xiàn)其在SCI后表達(dá)明顯增高，與SCI后早期存在一系列針對(duì)受損脊髓細(xì)胞的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)〔4〕。有效調(diào)控SCI后TLR4動(dòng)態(tài)表達(dá)可為SCI治療提供思路。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有強(qiáng)大增殖和多向分化的潛能，是位于骨髓腔內(nèi)的一類非造血干細(xì)胞〔5,6〕。本研究擬觀察SCI大鼠BMSCs移植后TLR4的表達(dá)，進(jìn)一步探討B(tài)MSCs抑制炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 4周齡雄性Wistar大鼠6只，清潔級(jí)，體重110～130 g，平均(120.47±4.31)g，提取BMSCs；8周齡雄性Wistar大鼠100只，清潔級(jí)，體重110～130 g，平均(112.35±5.10)g，建立SCI模型。大鼠均由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證：SCXK(魯)20130009。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于同一環(huán)境中，溫度26～28℃，濕度40%～60%，光周期調(diào)節(jié)為12 h/24 h，實(shí)驗(yàn)前所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑和藥物 0.25%胰酶(HyClone)，培養(yǎng)基DMEM/F-12(Life Technologies Corporation)，青、鏈霉素(美國Solarbio)，氨芐青霉素鈉、胎牛血清(FBS，浙江四季青生物工程材料有限公司)；兔抗大鼠單抗TLR4(BOSTER)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(H+L)(ZSGB-BIO)；濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(ZSGB-BIO)；小鼠抗大鼠單克隆抗體CD90.1(Thy-1.1)-PE(eBioscience)；小鼠抗大鼠單克隆抗體CD45-FITC(eBioscience)；小鼠抗大鼠單克隆抗體CD29(Integrin beta 1)-FITC(eBioscience)；cDNA第一鏈合成試劑盒(Thermo Fisher)；TRIzol試劑盒(eBioscience)；瓊脂糖(Biowest)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR主混合液(TOYOBO)。

1.3儀器 164-5051-PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀(美國Bio-Rad)，BL21S-分析天平(德國Sartorius)，T02323-二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Sheldon Plumbing Inc.)，PM-10AD-倒置相差顯微鏡(日本Olympus)，XW-80A-渦旋振蕩器(其林貝爾儀器制造有限公司)，ST16R-高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Sorvall)，UV-2450-紫外光度儀(日本SHIMADZU)，2 ml-組織勻漿器(海門市愛苯德實(shí)驗(yàn)器材有限公司)， HY-4-脫色搖床(江蘇金壇市正基儀器有限公司)，HS-840U-超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，YY0088-92-微量進(jìn)樣器(江蘇欣悅玻璃儀器有限公司)，G:BOX Chemi XR5-凝膠成像分析系統(tǒng)(Syngene,UN)，MDF-U7386S-sanyo超低溫冰箱(日本三洋公司)，F(xiàn)ACSCalibur-流式細(xì)胞儀(美國Becton Dicknson)，H7650-透射式電子顯微鏡(日本日立公司)，200目細(xì)胞過濾篩(北京索萊寶科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1SCI大鼠模型制備 模型大鼠制備參照Song等〔7〕的垂直打擊方法：腹腔注射10%水合氯醛麻醉，大鼠固定，取俯臥位。對(duì)手術(shù)視野區(qū)皮膚常規(guī)消毒。以T10位置為中心，縱向切開大鼠背部皮膚，鈍性分離皮下組織，切口約4.0 cm，分離錐旁肌肉，暴露T9～T11椎骨；用錐板鉗去除T9～T11棘突及錐板，充分暴露T10段骨髓。提前固定艾倫試驗(yàn)打擊裝置，從約10 cm高度的位置讓5 g的固體打擊物垂直下落并對(duì)T10段脊髓部位準(zhǔn)確打擊。用含有青、鏈霉素的生理鹽水對(duì)傷口進(jìn)行沖洗，隨后逐層縫合組織。造模完成后，對(duì)所造模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：在用艾倫試驗(yàn)裝置垂直撞擊大鼠脊髓時(shí)，大鼠尾巴發(fā)生翹起并迅速倒下，身體抖動(dòng)，雙下肢迅速回縮，打擊部位非常迅速的出現(xiàn)淤血征象。不符合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，或因尿、便潴留，感染等原因死亡的大鼠均未納入此次研究。

1.4.2BMSCs的培養(yǎng)、鑒定及移植

1.4.2.1BMSCs懸液收集 斷頸處死重約120 g的雄性Wistar大鼠，將其于75%酒精中全身浸泡15 min消毒。無菌條件下迅速取出股骨和脛骨，剪斷兩端骨垢端使骨髓腔充分暴露，空針吸取含10 ml左右的DMEM/F-12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗液并吹打后過濾，配平離心管，1 200 r/min離心5 min，棄上清液；5 ml加入培養(yǎng)基吹打混勻并重懸、收集細(xì)胞。

1.4.2.2培養(yǎng)、擴(kuò)增 以1×108/L的濃度將收集到的BMSCs接種于無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3～4 d進(jìn)行1次全部換液，每日利用倒置顯微鏡對(duì)BMSCs細(xì)胞形態(tài)變化及生長情況進(jìn)行觀察，生長達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代：瓶內(nèi)培養(yǎng)基棄去后加入2 ml胰酶消化液進(jìn)行消化，采用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，當(dāng)貼壁細(xì)胞形態(tài)大部分變圓，細(xì)胞間間隙變大并開始脫落時(shí)，將含有FBS的培養(yǎng)基加入使消化終止；1 200 r/min收集細(xì)胞懸液并離心，棄去上清液，加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4.2.3鑒定 用0.25%胰酶消化并收集已貼壁的P3、P4代細(xì)胞，1 000 r/min×5 min，4℃離心，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，設(shè)A、B、C共3組樣品，每組樣品最小細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為106/100 μl，3組樣品分別加入小鼠抗大鼠單克隆抗體CD29-FITC、小鼠抗大鼠單克隆抗體CD90-PE、兔抗大鼠單克隆抗體CD45-FITC各10 μl，同時(shí)設(shè)立每管樣品的同型陰性對(duì)照。冰盤上避光孵育30 min，用含1%BSA的PBS洗滌細(xì)胞3次，1 000 r/min離心5 min，用含1%BSA的PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

1.4.2.4重懸、計(jì)數(shù) 收集P3代細(xì)胞，PBS緩慢洗滌細(xì)胞；加入胰酶消化液5 ml消化，采用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，當(dāng)貼壁細(xì)胞形態(tài)大部分變圓，細(xì)胞間間隙變大并開始脫落時(shí)，將含有FBS的培養(yǎng)基加入使消化終止；離心及PBS漂洗3次，對(duì)收集到的BMSCs細(xì)胞重懸并計(jì)數(shù)，使每0.2 ml PBS含BMSCs細(xì)胞2×106個(gè)備用。

1.4.2.5移植 隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、BMSCs移植組(簡稱移植組)；后2組又各分為1 d，3 d，7 d 3個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，每組15只，假手術(shù)組10只。SCI模型建立后，對(duì)移植組大鼠立即用微量移液管經(jīng)尾靜脈緩慢注入BMSCs單細(xì)胞懸液200 μl。操作中須保證注射時(shí)間至少3 min以上，注射完畢后留針5 min以上。假手術(shù)組和模型組大鼠經(jīng)尾靜脈給予等體積的生理鹽水。大鼠術(shù)前12 h開始禁食，不禁水。

1.5取材 各組根據(jù)時(shí)間點(diǎn)分別于尾靜脈用藥后1 d、3 d、7 d取材，假手術(shù)組于術(shù)后7 d取材；采用10%水合氯醛麻醉大鼠，并用4%的多聚甲醛溶液進(jìn)行組織灌注固定，沿背部原切口進(jìn)入，鈍性分離皮下組織及肌肉，迅速切斷神經(jīng)根，游離脊髓，切取損傷中心1 cm脊髓組織備用。

1.6指標(biāo)檢測 ①脊髓功能評(píng)分。采用脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能(BBB)評(píng)分法〔8〕于移植后1 d，3 d，7 d對(duì)大鼠SCI前后的行為及后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)定。在評(píng)分前所有動(dòng)物檢查膀胱充盈度，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。②免疫組織化學(xué)染色法檢測TLR4表達(dá)，石蠟切片常溫放置30 min；依次放入二甲苯和酒精梯度脫蠟；0.01 mol/L的PBS洗滌3次，每次5 min；置入含胰酶濃度5 mg/ml、氯化鈣(CaCl2)濃度10 mg/ml的胰酶修復(fù)液中，置于37℃恒溫箱中酶修復(fù)20 min；PBS沖洗3次，每次5 min；放入3%過氧化氫(H2O2)內(nèi)10 min；PBS沖洗3次，每次5 min；置入0.03%聚乙二醇辛基苯基醚中孵育10 min；PBS沖洗3次，每次5 min；山羊血清封閉1 h；加入兔抗大鼠單抗TLR4(濃度1∶100)后于4℃條件下過夜，陰性對(duì)照組加PBS；PBS沖洗3次，每次5 min；加入二抗，孵育1 h，DAB顯色，常規(guī)脫水并封片。記錄平均光密度值(MOD)。③實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。利用TRIzol試劑盒提取總RNA，測定RNA含量并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。采用20 μl反應(yīng)體系，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，引物序列如下：正義鏈：5′-CTCACACCTTCAGTGGCTGGATTTA-3′，反義鏈5′-GTCTCCACATCCACCAGATTATC-3′；?？偡磻?yīng)體系包括主混合液10 μl，cDNA 1 μl，0.1%焦碳酸二乙酯水7 μl，上下游引物各1 μl。目的基因表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs的鑒定 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，培養(yǎng)的BMSCs表面抗原中，CD29和CD90呈陽性表達(dá)，CD45呈陰性表達(dá)，P3代BMSCs CD29、CD90表達(dá)率分別為87.38%、71.26%，CD45表達(dá)率為0.56%；P4代BMSCs CD29、CD90表達(dá)率分別為88.20%、80.44%，CD45表達(dá)率為1.35%。表明分離獲得的細(xì)胞符合BMSCs的特征，結(jié)合培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)塑料底物的貼附特性及形態(tài)觀察，說明分離得到所需的BMSCs。

2.2脊髓功能評(píng)分 模型組大鼠BBB評(píng)分較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，移植組術(shù)后3 d、7 d BBB評(píng)分明顯升高(P<0.05)。同組間比較，模型組和移植組術(shù)后BBB評(píng)分均隨時(shí)間逐漸升高(P<0.05)。見表1。

2.3TLR4蛋白及mRNA表達(dá) 模型組TLR4蛋白及mRNA水平較假手術(shù)組明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，移植組1 d TLR4蛋白及mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，移植組3 d、7 d TLR4蛋白及mRNA水平均顯著降低(P<0.05)。同組間比較，模型、移植組TLR4蛋白及mRNA表達(dá)均呈先增后減趨勢，以損傷后3 d達(dá)高峰，7 d時(shí)顯著降低，以移植組降低明顯(P<0.05)。見表1。

表1 各組移植后不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分、TLR4蛋白及mRNA表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與同組別1 d組比較：3)P<0.05；與同組別3 d組比較：4)P<0.05

3 討 論

脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，主要由神經(jīng)元和起營養(yǎng)支持作用的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。SCI包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷兩種。原發(fā)性損傷是瞬時(shí)且不可逆的，是指由于撞擊力或機(jī)械力直接造成組織撕裂或變形〔9〕；繼發(fā)性損傷常發(fā)生在SCI后幾小時(shí)至數(shù)天內(nèi)，其損傷造成的后果中，既有損害激活的脊髓自身的慢性反應(yīng)性損傷，又有損傷周圍組織的炎癥性損傷〔10〕。研究顯示，引起脊髓繼發(fā)性損傷的具體機(jī)制有細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、電解質(zhì)失衡、創(chuàng)傷后缺血、線粒體功能紊亂、興奮性中毒、自由基損傷和再灌注損傷等，且繼發(fā)性損傷對(duì)脊髓的損傷程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過原發(fā)性損傷〔11，12〕。炎癥反應(yīng)在引起SCI的繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用，多種炎癥因子的浸潤，導(dǎo)致大量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞功能受損，并逐漸壞死和凋亡，而壞死、凋亡的細(xì)胞會(huì)釋放更多的炎癥因子，形成惡性循環(huán)，使損傷范圍不斷擴(kuò)大。小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生的神經(jīng)毒性在SCI后炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化被認(rèn)為是脊髓微環(huán)境改變最敏感的指標(biāo)之一〔13〕。SCI時(shí)，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞一方面釋放相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子以保護(hù)損傷的脊髓組織，另一方面又能釋放多種炎性因子通過相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，從而加重SCI〔14〕。而在這些炎癥因子中，Toll樣受體超家族中的TLR4的表達(dá)最為豐富。

TLR4被配體激活后可產(chǎn)生促炎因子和炎癥趨化因子，從而調(diào)節(jié)天然免疫，防止微生物入侵〔15〕。研究表明〔16〕，TLR4在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，可以作為起始因子啟動(dòng)相關(guān)炎性過程。研究證實(shí)〔17〕TLR4在SCI后炎性病理進(jìn)程中有重要作用。因此，探索有效降低SCI后TLR4的表達(dá)或許能為損傷后神經(jīng)功能修復(fù)提供新的思路。

BMSCs是一類具有多向分化潛能和高度自我更新能力的非造血干細(xì)胞，不僅能分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，也能分化成神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的功能恢復(fù)。BMSCs來源豐富，提取方便，易于分離純化和體外擴(kuò)增，且可免于倫理學(xué)爭議和移植后的免疫排斥問題，這就為SCI的干細(xì)胞移植治療提供理想的“種子細(xì)胞”〔18〕。研究顯示〔19〕，體外培養(yǎng)的BMSCs可通過直接注射移植、經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射移植、經(jīng)靜脈注射移植等多個(gè)途徑移植到SCI部位，通過向特定損傷部位的遷徙和歸巢，一方面向特定組織分化，以彌補(bǔ)壞死和凋亡的神經(jīng)細(xì)胞，另一方面可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，給壞死區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞提供“能量”，促使損傷后神經(jīng)修復(fù)和重建，此外其還能減輕損傷后的炎癥反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激，發(fā)揮促進(jìn)SCI恢復(fù)的作用。王晶等〔20〕研究顯示，將培養(yǎng)好的BMSCs經(jīng)肋間動(dòng)脈移植到SCI模型家兔體內(nèi)，能明顯促進(jìn)損傷后的神經(jīng)軸突的再生，且有效抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，顯著促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)。有學(xué)者〔21〕提出，BMSCs促進(jìn)SCI損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)可能與下調(diào)纖維酸性蛋白和CSPG表達(dá)有關(guān)，促進(jìn)損傷后神經(jīng)軸突的再生。

本研究結(jié)果顯示，SCI后大鼠行為學(xué)BBB評(píng)分顯著降低，隨著損傷時(shí)間的延長，大鼠BBB評(píng)分輕度恢復(fù)，提示SCI后機(jī)體自身可代償性的發(fā)揮抗損傷作用，其機(jī)制可能與自身的生理情況下處于休眠狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞向損傷的脊髓細(xì)胞分化以減輕損傷有關(guān)。但是，由于機(jī)體自身神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量有限，且損傷后局部微環(huán)境改變影響神經(jīng)干細(xì)胞的正常分化，因此，這種修復(fù)能力非常有限。而通過BMSCs移植后，移植組SCI模型大鼠行為學(xué)BBB評(píng)分顯著提高，提示BMSCs可顯著促進(jìn)SCI損傷后的功能恢復(fù)。在對(duì)TLR4表達(dá)的影響方面，SCI后TLR4表達(dá)顯著增高，提示SCI后炎性反應(yīng)被激活，各種炎癥介質(zhì)浸潤，而其中TLR4發(fā)揮重要作用。隨著損傷延長，TLR4表達(dá)呈先增后減趨勢。而BMSCs移植后，TLR4表達(dá)顯著降低，提示BMSCs移植能明顯抑制SCI后TLR4表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，應(yīng)用BMSCs移植可顯著促進(jìn)SCI后的神經(jīng)功能恢復(fù)，抑制損傷后的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與動(dòng)態(tài)干預(yù)損傷后TLR4的表達(dá)有關(guān)。