供體特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝移植免疫耐受中的意義

王凱，高偉

作為治療各種終末期肝病的有效手段，肝移植的存活率大幅提高，但術(shù)后仍面臨慢性排斥反應(yīng)、長期使用免疫抑制劑帶來的腎功能損害、感染、腫瘤、代謝并發(fā)癥等風(fēng)險(xiǎn)。誘導(dǎo)移植術(shù)后免疫耐受是解決這一問題的根本方法。肝臟作為免疫特惠器官，較其他臟器更容易實(shí)現(xiàn)免疫耐受。器官移植術(shù)后主動誘導(dǎo)免疫耐受的方案主要包括聯(lián)合骨髓移植誘導(dǎo)同種異基因嵌合體、受者術(shù)前T淋巴細(xì)胞清除、阻斷共刺激通路、過繼輸注免疫抑制細(xì)胞等［1］。其中，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）由于其免疫抑制特性成為研究的熱點(diǎn)，但常規(guī)Treg在作用時效、作用部位、多克隆Treg 細(xì)胞的遷移等方面均存在一定的局限性［2］。研究認(rèn)為，供體特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（donor specific regulatory T cell，DSTreg）可誘導(dǎo)移植術(shù)后受者產(chǎn)生針對供體抗原的特異性耐受，不服用免疫抑制劑而長期維持移植物功能正常［3］。而胸腺移植是產(chǎn)生并維持DSTreg細(xì)胞長期生存的有效途徑［4］。現(xiàn)就DSTreg 細(xì)胞在免疫耐受中的作用與意義進(jìn)行綜述。

1 Treg細(xì)胞的特性及其在排斥反應(yīng)中的作用

Treg細(xì)胞是一類具有強(qiáng)大免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，其特性主要是免疫低反應(yīng)性和免疫抑制。Treg細(xì)胞的免疫抑制作用是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要因素之一，其表達(dá)異?？梢鸲喾N自身免疫性疾病。Treg 細(xì)胞主要在胸腺與外周淋巴器官中發(fā)育，通常將其分為兩類，即胸腺來源的Treg細(xì)胞（nature Treg，nTreg）與在外周誘導(dǎo)生成的Treg細(xì)胞（induced Treg，iTreg）。nTreg 細(xì)胞與iTreg 細(xì)胞在功能上存在一定的差異，前者被認(rèn)為是免疫抑制能力較強(qiáng)的Treg 細(xì)胞亞群，在體內(nèi)維持免疫耐受中起根本性作用［5-6］，而iTreg細(xì)胞在外周誘導(dǎo)產(chǎn)生后功能受損，會失去調(diào)節(jié)免疫耐受的能力［7］。叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead/winged helix transcription factor p3，F(xiàn)oxp3）是CD4+Treg 細(xì)胞分化、發(fā)育、保持功能穩(wěn)定的重要因子，也是其最重要的鑒別標(biāo)志物。小鼠中區(qū)分nTreg 和iTreg 的標(biāo)志物是神經(jīng)纖毛蛋白1（neuropilin-1，Nrp1）［8］，而在人體內(nèi)則是Treg細(xì)胞特異性脫甲基區(qū)域（treg-specific demethylated region，TSDR）［9］。

Treg細(xì)胞與移植后排斥反應(yīng)密切相關(guān)。研究顯示，兒童肝移植患者在發(fā)生急性排斥反應(yīng)時，外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例降低，在抗排斥治療后進(jìn)一步下降，1 周后仍不能恢復(fù)正常［10］。其在成人患者中亦有相似表達(dá)，且伴有Treg 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的變化［11］。Zhou 等［12］利用大鼠肝移植模型發(fā)現(xiàn)，急性排斥反應(yīng)中Treg 細(xì)胞及其相應(yīng)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）顯著降低。

2 Treg細(xì)胞誘導(dǎo)移植術(shù)后免疫耐受

基于Treg 細(xì)胞的免疫抑制特性，其抑制排斥反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫耐受的作用相繼被證實(shí)。研究顯示，在停用免疫抑制劑5年以上的肝移植患者中，移植肝組織中 Treg 細(xì)胞比例明顯增加［13］。Chandran 等［14］將Treg 細(xì)胞在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后輸注于腎移植患者體內(nèi)，輸注過程安全，在降低免疫抑制劑的情況下，移植物僅存在輕度的炎癥反應(yīng)。但后續(xù)的研究表明，多克隆Treg細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受亦存在較多問題。細(xì)胞過繼輸注中所需的Treg 細(xì)胞數(shù)量巨大，而培養(yǎng)后的Treg細(xì)胞純度低且穩(wěn)定性差、體內(nèi)存活期短，輸注后還可導(dǎo)致受體免疫受限，進(jìn)而引發(fā)感染［15-16］。另有研究通過小鼠肝移植模型推算，小鼠體內(nèi)的Treg 細(xì)胞至少要增加33%才可達(dá)到預(yù)期的治療效果［17］。在一項(xiàng)臍帶血Treg細(xì)胞預(yù)防移植物抗宿主病的研究中，輸注的Treg細(xì)胞在體內(nèi)很快衰竭，半衰期大約在20 d 左右，且Treg 細(xì)胞衰減的程度與輸注的劑量無關(guān)［18］。同時，Treg 細(xì)胞也受免疫抑制藥物的影響，這也進(jìn)一步限制了其臨床應(yīng)用。在成人肝移植患者中，他克莫司對Treg 細(xì)胞存在明顯的抑制作用，且這種作用與他克莫司濃度有關(guān)，高濃度他克莫司對 Treg 細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)［19］。針對 Treg 細(xì)胞在免疫誘導(dǎo)中存在的諸多不足，研究者相繼采取了很多方法以提高Treg 細(xì)胞的分化比例，穩(wěn)定擴(kuò)增后的表型與抑制功能。Hajkova等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)中加用雷帕霉素可以顯著提升體外培養(yǎng)體系中Foxp3的表達(dá)水平。另有研究認(rèn)為，增加TGF-β、IL-2 等細(xì)胞因子可以促進(jìn)Treg 細(xì)胞的分化、修復(fù)其調(diào)節(jié)功能［21］；使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還可以誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化［22］。盡管上述方案可以在很大程度上增強(qiáng)Treg 細(xì)胞的分化與功能，但缺乏對供體抗原的特異性抑制，從而使其數(shù)量仍無法達(dá)到有效誘導(dǎo)免疫耐受的目的。因此，有研究認(rèn)為只有足夠數(shù)量的Treg細(xì)胞到達(dá)移植物和局部淋巴結(jié)等炎癥反應(yīng)部位，才可有效抑制效應(yīng)細(xì)胞的作用［23］。

3 DSTreg細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制功能

DSTreg 細(xì)胞可以特異性作用于供體效應(yīng)細(xì)胞，僅用少量的細(xì)胞就可以達(dá)到抑制排斥反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫耐受的目的。在實(shí)體器官移植中已經(jīng)證實(shí)，DSTreg 細(xì)胞比多克隆Treg 細(xì)胞在抗排斥反應(yīng)中更有潛力［24］。在小鼠心臟移植模型中發(fā)現(xiàn)，持續(xù)使用西羅莫司、環(huán)孢霉素、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associat-ed antigen 4，CTLA4-Ig）等藥物并不會促進(jìn)DSTreg 細(xì)胞的擴(kuò)增，只是抑制常規(guī)T 細(xì)胞的擴(kuò)增，而排斥或耐受的效果與移植物中積聚的DSTreg 細(xì)胞的比例有關(guān)［25］。Todo等［26］在CD80/CD86單克隆抗體存在的情況下，將成人親體肝移植受者的淋巴細(xì)胞與經(jīng)過照射的供者細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，產(chǎn)生DSTreg 細(xì)胞，在肝移植術(shù)后早期將培養(yǎng)后的細(xì)胞輸注至受者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受，隨訪16～33個月，10例患者中7例完全停用免疫抑制劑，其中4例停藥超過24個月。

獲得DSTreg細(xì)胞的傳統(tǒng)方法是在伴有T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）的環(huán)境下，將Treg 細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞、特定抗原一起培養(yǎng)。Mathew等［27］利用可溶性CD40L激活供體B細(xì)胞與受者Treg細(xì)胞共培養(yǎng)，得到了純度較高的 DSTreg 細(xì)胞。Monti 等［28］認(rèn)為雷帕霉素不僅對常規(guī)Treg 細(xì)胞有促進(jìn)作用，而且可以促進(jìn) DSTreg 細(xì)胞的增殖。Ratnasothy 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，IL-2可明顯提高DSTreg細(xì)胞抑制排斥反應(yīng)的效果，延長移植物存活時間。不僅如此，耐受模型中提取的DSTreg 細(xì)胞在輸注給同種移植受體后亦具備特異性免疫抑制功能［30-31］。然而，Kotsiou 等［32］研究認(rèn)為，DSTreg 細(xì)胞在培養(yǎng)擴(kuò)增后表型與抑制功能不變，但會喪失部分趨化功能。因此，利用這些方法得到的供體抗原特異性Treg 細(xì)胞在體外擴(kuò)增后，大部分會失去抗原特異性，作用有限。

4 T細(xì)胞受體的Treg細(xì)胞（T cell receptor Treg，TCR-Treg）與嵌合抗原受體Treg細(xì)胞（chimeric antigen receptor Treg，CAR-Treg）

為了克服傳統(tǒng)培養(yǎng)的DSTreg 細(xì)胞的不足，利用基因工程技術(shù)，通過結(jié)合TCR產(chǎn)生的TCR-Treg細(xì)胞可以更好地維持抗原特異性功能［33］。TCR信號對于Treg 細(xì)胞的產(chǎn)生、分化、抑制功能非常關(guān)鍵，Treg 發(fā)揮抑制功能主要依賴于TCR接觸［34］。Savage等［35］利用供者B細(xì)胞激活受者Treg細(xì)胞，再結(jié)合TCR，輸注于腎移植聯(lián)合骨髓移植的患者，利用TCR-Treg細(xì)胞在體內(nèi)增殖，成功誘發(fā)免疫耐受，而受者體內(nèi)TCRTreg細(xì)胞可存活6個月。但TCR-Treg細(xì)胞受主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的限制，難以普遍應(yīng)用。研究顯示，在TCRTreg 細(xì)胞的基礎(chǔ)上，將供體MHC 與Treg 細(xì)胞結(jié)合，得到CAR-Treg細(xì)胞，相比于多克隆Treg細(xì)胞，CARTreg細(xì)胞抑制能力更強(qiáng)，且可以彌補(bǔ)TCR-Treg細(xì)胞的MHC相容性的問題［36-37］。Zhang等［38］認(rèn)為，CARTreg細(xì)胞對IL-2的依賴較TCR-Treg細(xì)胞小，可以維持穩(wěn)定的表型和功能，更容易遷移至靶器官。Noyan等［39］研究中，CAR-Treg 細(xì)胞展示了比 nTreg 細(xì)胞更強(qiáng)的抑制功能，無論在體外還是在人源化小鼠模型中均可抑制免疫排斥反應(yīng)。但CAR-Treg 細(xì)胞的不足是輸注后有可能引起細(xì)胞因子“風(fēng)暴”和神經(jīng)系統(tǒng)毒性，另外靶標(biāo)抗原的選擇、特異性抗體的產(chǎn)生難度較大，容易出現(xiàn) CAR-Treg 細(xì)胞衰竭［38］。UniCARTreg 細(xì)胞作為新一代技術(shù)產(chǎn)物，可在一定程度上消除MHC 的限制與 TCR 的影響，提高移植安全性［40］，但其在臨床中的實(shí)際效果有待進(jìn)一步研究。

5 胸腺在DSTreg細(xì)胞產(chǎn)生中的作用與胸腺移植在誘導(dǎo)移植免疫耐受中的作用

在兒童時期，胸腺是一個高度強(qiáng)大的免疫器官，是T細(xì)胞發(fā)育、成熟的場所，對于誘導(dǎo)供體特異性耐受非常關(guān)鍵。胸腺Treg 細(xì)胞由2 部分組成，一部分是由CD4 單陽性胸腺細(xì)胞新生成的Treg 細(xì)胞，另一部分是進(jìn)入胸腺再循環(huán)的外周Treg細(xì)胞。在人類和小鼠中，nTreg細(xì)胞幾乎全部依賴于胸腺產(chǎn)生。兒童胸腺中的Treg細(xì)胞非常豐富，1 g胸腺組織所含Treg細(xì)胞大約是1 mL，是外周血的500倍，而且在擴(kuò)增后功能穩(wěn)定［41］。新生兒胸腺的微解剖屏障對外來細(xì)胞的限制沒有成人胸腺那么嚴(yán)格，更容易產(chǎn)生DSTreg細(xì)胞；新生兒胸腺通過消耗進(jìn)入胸腺的效應(yīng)T細(xì)胞，提高誘導(dǎo)中樞免疫耐受的效果。DSTreg細(xì)胞的產(chǎn)生主要是通過胸腺中的抗原呈遞細(xì)胞來完成，包括胸腺樹突細(xì)胞和胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞。在現(xiàn)階段的移植模型中，胸腺產(chǎn)生供體抗原特異性Treg 細(xì)胞主要有2種方式，一種是供體胸腺（組織）移植，另一種為向受體的胸腺中注射供體抗原。

在臨床上，胸腺移植主要用于治療兒童先天性胸腺缺如或胸腺切除所繼發(fā)的免疫缺陷性疾病，如DiGeorge 綜合征等。在移植領(lǐng)域，胸腺移植主要在兒童心臟移植的病例中開展［42］。在基礎(chǔ)研究中，除免疫缺陷病以外，胸腺移植的研究主要涉及供體特異性T 細(xì)胞。在一項(xiàng)小鼠胸腺移植的研究中，受體體內(nèi)供者來源的CD3+T細(xì)胞的總數(shù)在移植術(shù)后前4周內(nèi)升高，而后開始下降；進(jìn)入胸腺再循環(huán)的初始型CD4+T 細(xì)胞的生存期較短，而此時移植物內(nèi)的胸腺細(xì)胞的數(shù)量已達(dá)到正常小鼠的水平［43］。Yamada等［44］認(rèn)為在異種移植中，同時行胸腺移植可以產(chǎn)生抗原特異性T 細(xì)胞，延長移植物存活時間，但在豬、犬等大動物模型中，所移植的胸腺需要血管重建。Cooper等［45］認(rèn)為盡管胸腺移植產(chǎn)生的供體抗原特異性T 細(xì)胞可延長移植物存活時間，有助于誘導(dǎo)免疫耐受，但由于其有作用時間并非終生、細(xì)胞比例偏低等問題，尚不足以實(shí)現(xiàn)長期、完全停用免疫抑制劑。

6 結(jié)語

隨著手術(shù)技術(shù)的成熟，器官移植的關(guān)注點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)移到提高移植受者的生存質(zhì)量與遠(yuǎn)期存活率，實(shí)現(xiàn)免疫耐受是器官移植在挽救患者生命的同時所達(dá)到的最理想狀態(tài)。DSTreg細(xì)胞可保持免疫抑制的抗原特異性，而胸腺移植可維持抗原特異性免疫抑制的持久性，二者的結(jié)合或可為今后肝移植提供誘導(dǎo)免疫耐受的新策略。