數(shù)字PCR技術(shù)研究進(jìn)展

李智杰，劉占悝，李健友，劉澤余，郭利※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130118）

數(shù)字PCR（Digital PCR）是于20 世紀(jì)由Vogelstein等[1]提出的用于核酸分子定量精密檢測(cè)的一種方法。它是將稀釋后的核酸模板分配到大量不同的反應(yīng)單元中，使每個(gè)反應(yīng)單元中有一個(gè)或沒有核酸。利用PCR擴(kuò)增的同時(shí)，加入可檢測(cè)熒光。待擴(kuò)增結(jié)束時(shí)，使用泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采集每個(gè)反應(yīng)單元出現(xiàn)的熒光次數(shù)，從而定量檢測(cè)樣本中的核酸濃度。由于數(shù)字PCR采取先擴(kuò)增后定量，因此不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值，也不需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。具有準(zhǔn)確度高、可以定量分析的優(yōu)點(diǎn)。

1 數(shù)字PCR原理

數(shù)字PCR 是PCR 擴(kuò)增和熒光信號(hào)采集兩個(gè)部分先后交替進(jìn)行。它的關(guān)鍵是模板的稀釋。通過將模板大量稀釋，盡可能使反應(yīng)單元中只存在1 個(gè)或沒有模板，在每次PCR 擴(kuò)增后，對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元進(jìn)行熒光信號(hào)計(jì)數(shù)。出現(xiàn)熒光的反應(yīng)單元計(jì)數(shù)為1，沒出現(xiàn)熒光信號(hào)的計(jì)數(shù)為0。理論上，每個(gè)反應(yīng)單元中的模板數(shù)為1 個(gè)或0 個(gè)，但是實(shí)際操作中，很難做到這點(diǎn)，因此就需要應(yīng)用泊松分布公式來計(jì)算樣本初濃度[1]。數(shù)字PCR 采用的是終點(diǎn)檢測(cè)熒光數(shù)量，不依賴擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值，也不需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，受PCR 擴(kuò)增效率的影響較小，且對(duì)PCR 反應(yīng)抑制物的耐受能力高，數(shù)據(jù)精密、準(zhǔn)確[2]。

2 數(shù)字PCR的分類

數(shù)字PCR 從概念提出到商業(yè)化生產(chǎn)在短短幾十年間經(jīng)歷了飛速發(fā)展。根據(jù)分液方式的不同，數(shù)字PCR主要分為微孔板數(shù)字PCR、微滴數(shù)字PCR以及芯片數(shù)字PCR。最初，分配分子模板是在96/384 孔微孔板中進(jìn)行[1，3]，面對(duì)復(fù)雜的樣品仍采用手動(dòng)稀釋加樣方法，會(huì)帶來巨大加樣誤差。由于數(shù)字PCR 技術(shù)的準(zhǔn)確程度取決于反映單元的總數(shù)，即反映單元數(shù)目越多，越有利于數(shù)字PCR 的準(zhǔn)確度。因此，96/384 孔板也無法滿足反應(yīng)需要。

隨著自動(dòng)化系統(tǒng)水平日漸完善，在過去的10年中，不同公司正在探索不同的技術(shù)和方法來實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR 自動(dòng)化。目前，可用的數(shù)字平臺(tái)在分液數(shù)量、液滴生成方法以及所需專用設(shè)備方面有所不同。BioMarkTMHD系統(tǒng)提供專用于數(shù)字集成流體回路（IFCs）的矩陣，可將樣品分配在多個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)室中；QuantStudio 3D系統(tǒng)采用硅芯片，該硅芯片由單個(gè)反應(yīng)孔按一定順序排列組成，可使樣品按其矩陣進(jìn)行分配；CONSTELLATION數(shù)字PCR 系統(tǒng)采用微孔板，通過利用密封的壓縮軸形成微管將樣本液體通道分離成單獨(dú)的微流體室；其他數(shù)字PCR 平臺(tái)，如QX200TMDropletDigitalTMPCR 和RainDropplusTM數(shù)字PCR 系統(tǒng)使用油包水乳化進(jìn)行分區(qū)，水相由引物、探針或熒光染料組成并混合成超預(yù)混合物，樣品和礦物油則裝入專門設(shè)計(jì)的支架中，液滴發(fā)生器使用微流體產(chǎn)生壓力，將水相和油相吸入輸出通道，在此過程中形成液滴，每個(gè)液滴在特定的液滴讀取器中逐一讀??；來自Stilla TechnologieTM公司的Naica 系統(tǒng)就是結(jié)合了陣列和乳化這兩種方法，在這個(gè)系統(tǒng)中，樣品通過芯片的通道并在芯片內(nèi)部形成液滴，成為較為理想的數(shù)字PCR 技術(shù)平臺(tái)。

3 數(shù)字PCR的檢測(cè)方法

與熒光定量PCR 相似，數(shù)字PCR 主要使用核酸分子染料和水解探針這兩種方式來檢測(cè)核酸[4]。這兩種檢測(cè)方法都會(huì)得到與核酸量成比例的熒光信號(hào)。核酸分子染料插入雙鏈DNA，并與雙鏈DNA 相互作用后，呈現(xiàn)激發(fā)態(tài)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。核酸分子染料是非特異性的，無論DNA分子序列如何，都可以與其相互作用。相比之下，水解探針與序列結(jié)合是特異性的。熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針在與靶序列雜交后可以被DNA聚合酶的5'至3'端外切核酸酶切割，此時(shí)，位于寡核苷酸探針5'末端的熒光報(bào)告染料就被釋放并產(chǎn)生熒光信號(hào)。

4 數(shù)字PCR的風(fēng)險(xiǎn)與優(yōu)勢(shì)

4.1 假陽性

目前，所有的數(shù)字PCR平臺(tái)都會(huì)受到污染及其帶來的假陽性結(jié)果[5-10]。Kiselinova 等[8]在測(cè)定HIV-1RNA的陰性對(duì)照的3個(gè)孔中仍然檢測(cè)到陽性液滴（0.16～0.22拷貝/反應(yīng)）。經(jīng)查證后發(fā)現(xiàn)，這些液滴與患者樣品中的真正陽性液滴具有相似的熒光強(qiáng)度。這些假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)的原因仍不清楚，人們對(duì)此提出了各種假設(shè)。錯(cuò)誤的陽性結(jié)果可能來自不良的檢測(cè)設(shè)計(jì)或由于PCR循環(huán)數(shù)量較多而檢測(cè)到其他非目的條帶。另外，假陽性液滴可能由污染物或混合在一起時(shí)的液滴產(chǎn)生，它們的相互作用形成具有較高亮度熒光液滴，導(dǎo)致假陽性熒光出現(xiàn)。

4.2 優(yōu)勢(shì)

除了假陽性問題之外，數(shù)字PCR在很多方面與熒光定量PCR 結(jié)果相同或更好。這兩種PCR 之間的主要區(qū)別是其對(duì)于測(cè)量靶序列數(shù)量的方法不同。在熒光定量PCR整個(gè)擴(kuò)增過程中都有監(jiān)測(cè)反應(yīng)，并且定量是基于指數(shù)階段熒光信號(hào)的分析。數(shù)字PCR 是通過終點(diǎn)測(cè)量收集熒光信號(hào)，并使用總量上的陽性分區(qū)數(shù)來倒推出目標(biāo)濃度。數(shù)字PCR 不依賴于校準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品定量，避免了與反應(yīng)效率變化相關(guān)的缺陷[11]。數(shù)字PCR是對(duì)核酸進(jìn)行絕對(duì)定量的一種方法，依賴于終點(diǎn)熒光信號(hào)的檢測(cè)和兩點(diǎn)分布（反應(yīng)中熒光的不存在或存在）[12]。用于執(zhí)行樣品分配以及單個(gè)分子擴(kuò)增的數(shù)字PCR 理論上優(yōu)于熒光定量PCR。但實(shí)際上，在已經(jīng)發(fā)表的文章中顯示，熒光定量PCR平臺(tái)具有更高的敏感性，這可能與樣品量有關(guān)[13-14]。在連接目的DNA雙鏈的數(shù)字PCR 實(shí)驗(yàn)中，觀察到少數(shù)分區(qū)，在2 個(gè)反應(yīng)孔中只有1 個(gè)孔顯示擴(kuò)增[15]。造成這種結(jié)果是因?yàn)镈NA 連接酶和目標(biāo)模板結(jié)合后的鈍性分離還是真正的擴(kuò)增失敗，現(xiàn)在仍然不清楚。推測(cè)原因可能是存在特異性模板擴(kuò)增抑制劑，模板降解或有三級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，如果真的不能擴(kuò)增，目前還不清楚是否僅與使用數(shù)字PCR 有關(guān)，還是在熒光定量PCR 的情況下是也存在類似的機(jī)制。

5 數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用

數(shù)字PCR以其極高的靈敏度主要應(yīng)用于疾病檢測(cè)診斷和微生物檢測(cè)分析上。

5.1 疾病診斷

Furuya D 等[16]使用QuantStudio 3D 數(shù)字PCR 檢測(cè)到Wilms tumor 1（WT1）因子在造血系統(tǒng)腫瘤中過表達(dá)。結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性非常強(qiáng)（R=0.99）。但數(shù)字PCR 能夠準(zhǔn)確檢測(cè)至更低的WT1 含量，可用于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)WT1/ABL1 的表達(dá)水平，因此，可用于診斷或評(píng)價(jià)白血病患者的藥物效率。

5.2 細(xì)菌活菌計(jì)數(shù)

使用平板計(jì)數(shù)來統(tǒng)計(jì)益生菌數(shù)量是目前較為普遍的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，但該方法實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，不能區(qū)分細(xì)菌菌株。Hansen SJZ 等[17]使用基于芯片的數(shù)字PCR 來檢測(cè)雙歧桿菌屬的亞種，利用不同基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，使用單丙酰疊氮預(yù)處理以防止誤擴(kuò)增死亡的益生菌DNA，使用玻璃珠震蕩破碎細(xì)菌，使DNA 從具有完整膜的細(xì)胞中釋放。該優(yōu)化的測(cè)定法都能成功地檢測(cè)每個(gè)菌株。芯片數(shù)字PCR 方法對(duì)于乳酸菌Bl-04 和嗜酸乳桿菌NCFM分別具有4%和5%的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，比平板計(jì)數(shù)更精確。由于其準(zhǔn)確性、應(yīng)變特異性和在數(shù)小時(shí)內(nèi)就可以獲得結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，使得數(shù)字PCR 有可能取代傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)。

5.3 噬菌體研究

目前，噬菌體的研究方法很少，原因是噬菌體可培養(yǎng)性的限制以及通用的基因標(biāo)記的缺乏。Morella NM等[18]運(yùn)用液滴數(shù)字PCR 檢測(cè)到丁香假單胞菌和針對(duì)其捕食的兩種噬菌體在使用培養(yǎng)基共培養(yǎng)和番茄感染過程中，隨時(shí)間推移，噬菌體跟蹤細(xì)菌過程和噬菌體的密度，比較噬菌體附著率，并探索噬菌體-噬菌體競(jìng)爭(zhēng)動(dòng)態(tài)。結(jié)果證明，液滴數(shù)字PCR 可研究菌體內(nèi)、外細(xì)菌-噬菌體動(dòng)力學(xué)。使用液滴數(shù)字PCR 方法與更傳統(tǒng)的噬菌斑形成單位（PFU）的計(jì)數(shù)結(jié)果相同，但使用數(shù)字PCR能更快得出結(jié)果，更低的浪費(fèi)和更高通量的研究噬菌體與細(xì)菌相互作用的方式，使得數(shù)字PCR將成為噬菌體研究中的一種新的有價(jià)值的工具。

5.4 癌癥的早期研究

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是活腫瘤細(xì)胞釋放的DNA，半衰期約為1.5h。對(duì)循環(huán)腫瘤DNA 進(jìn)行及時(shí)監(jiān)測(cè)分析，不僅有利于早期發(fā)現(xiàn)癌癥，還能監(jiān)測(cè)癌癥復(fù)發(fā)情況，這對(duì)癌癥患者的發(fā)病率和死亡率產(chǎn)生重大影響。與腫瘤組織活檢相比，血液循環(huán)腫瘤DNA 分析具有微創(chuàng)性，可以定期隨訪癌癥患者監(jiān)測(cè)癌癥。然而，使用ctDNA進(jìn)行早期癌癥診斷也并不容易，因?yàn)檠褐写嬖诘哪[瘤DNA 的量較少，并且腫瘤DNA 會(huì)被源自非腫瘤細(xì)胞的DNA 稀釋。基于液滴的數(shù)字PCR 等新技術(shù)的開發(fā)大大提高了檢測(cè)稀有序列的靈敏度、特異性和精確度，為癌癥的早期研究和診斷奠定基礎(chǔ)[19]。

6 展望

數(shù)字PCR 作為一種新興技術(shù)，與熒光定量PCR等定量分析的PCR技術(shù)相比，具有非常高的準(zhǔn)確性和靈敏度。數(shù)字PCR 在核酸檢測(cè)定量、抗病毒治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷具有重要的意義。它的出現(xiàn)，為研究者提供新的檢測(cè)方法和實(shí)驗(yàn)思路。但從實(shí)際操作角度來說，數(shù)字PCR 的實(shí)驗(yàn)設(shè)備費(fèi)用高昂、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜這些還不足以完全取代熒光定量PCR。此外，由于檢測(cè)癌癥或者腫瘤是依靠檢測(cè)血液中的癌癥標(biāo)記物而進(jìn)行的，但是癌癥或者腫瘤釋放的可用于檢測(cè)的生物標(biāo)記物是隨機(jī)的，因此，如何選擇相應(yīng)的標(biāo)記物來預(yù)測(cè)癌癥還需要進(jìn)行大量研究。其次，由于數(shù)字PCR 靈敏度非常高，對(duì)于診斷未知和復(fù)雜的案例可能會(huì)出現(xiàn)假陽性，因此，還需要結(jié)合案例的實(shí)際情況加以判斷。對(duì)于檢測(cè)稀有核酸種類樣本，可能存在抽樣偏差，導(dǎo)致待分析的目的基因片段未出現(xiàn)在取樣樣本中，從而導(dǎo)致假陰性出現(xiàn)。相信隨著數(shù)字PCR 技術(shù)的發(fā)展和商品化程度的提高，數(shù)字PCR 的診斷會(huì)更加正確，通量將會(huì)更高，成本更低，未來在科學(xué)研究領(lǐng)域?qū)?huì)發(fā)揮更重要的作用。