羊乳制品摻假檢測技術研究進展

文/張昊陽 嚴 林 黨高平 劉永峰

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院）

1 國內(nèi)外乳制品摻假檢測現(xiàn)狀

羊乳制品因其較高的營養(yǎng)價值以及獨特的口味越來越受到人們的追捧。與牛乳相比，羊乳的營養(yǎng)價值相對較高、過敏原含量較低、與人乳更接近，較適用于牛乳過敏人群[1]。

我國羊乳源主要集中在陜西、山東等地，奶山羊存欄量有限，且奶山羊泌乳期短、產(chǎn)量低，冬季為奶山羊干奶期，一天產(chǎn)量只有5 kg左右[2]。近年來，羊乳的價格高于牛乳，使得一些商家在利益驅(qū)動下將牛乳摻入羊乳中。這種現(xiàn)象會擾亂乳制品市場，進而制約乳制品行業(yè)的發(fā)展，因此對羊乳摻入牛乳檢測技術深入研究十分必要。目前常用于定量檢測牛羊乳混摻的方法都是以其中蛋白質(zhì)、脂肪、DNA、維生素等為特征指標建立的[3]。

1．1 國內(nèi)外乳制品摻假事件

2008年爆發(fā)的三鹿牌“嬰幼兒奶粉事件”引起了社會的廣泛關注，國產(chǎn)奶粉出現(xiàn)嚴重的信任危機，隨后國家成立了全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項整治領導小組。19世紀牛乳摻假也曾使英國的牛乳行業(yè)臭名昭著。國外牛乳摻水現(xiàn)象最為普遍，經(jīng)過脫脂、摻水的牛乳變得稀薄，商販們便往牛乳中添加各種替代物，如添加面粉或淀粉以增加牛乳的黏稠度，添加胡蘿卜汁以增加牛乳含脂量及甜味，甚至會摻入動物腦髓使牛乳產(chǎn)生泡沫。2013年，巴西的5 家奶牛場在原料牛乳中摻入大量井水，而為使蛋白質(zhì)含量達到要求，再向其中摻入大量尿素。

1．2 國內(nèi)外乳制品摻假法規(guī)與標準

面對乳制品行業(yè)以次充好，以假充真的作假行為，國內(nèi)外乳制品安全管理部門下發(fā)了相關政策文件進行整治，對于現(xiàn)在乳制品的健康發(fā)展起到了積極地推動作用。

2015年，我國針對國內(nèi)羊乳產(chǎn)業(yè)中羊奶粉摻牛乳清粉侵犯消費者知情權這一行業(yè)潛規(guī)則亂象，特別要求商家對羊奶粉進行具體標注，尤其要在配料表中標明每100 g產(chǎn)品中羊乳（粉）所占比例，以及乳清蛋白粉的來源。2008年10月通過的《乳制品質(zhì)量安全監(jiān)督管理條例》中明確規(guī)定,生鮮乳收購者、乳品企業(yè)在生鮮乳收購、乳制品生產(chǎn)過程中，加入非食品用化學物質(zhì)或者其他可能危害人體健康的物質(zhì)，依照刑法第144條的規(guī)定，構成犯罪的，依法追究刑事責任，并由發(fā)證機關吊銷許可證照。2010年3月26日衛(wèi)生部公布了《生乳》（GB19301—2010）等66 項新乳制品安全國家標準。

發(fā)達國家對食品安全的檢測與監(jiān)督體系更為成熟，1962年成立的國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC），制定的《國際食品法典》（Codex）已被世界貿(mào)易組織（World Trade Organization，WTO）認可為國際農(nóng)產(chǎn)品及食品貿(mào)易仲裁的重要參考依據(jù)，匯集了國際食品法典委員會已經(jīng)批準的標準、規(guī)范、準則和其他等。Codex法典的縱向產(chǎn)品標準主要規(guī)定了原料要求、成分指標、可用添加劑、污染物指標、衛(wèi)生、標簽等。

2 羊乳摻入牛乳檢測方法研究進展

目前，羊乳摻入牛乳檢測主要依據(jù)牛乳、羊乳各營養(yǎng)成分的差異展開，包括蛋白質(zhì)與氨基酸、脂肪與脂肪酸、β-胡蘿卜素以及DNA分子的差異等?；诓煌町?，得到了不同的檢測方法，包括：基于牛羊乳中蛋白質(zhì)分子構成不同的反相高效液相色譜、電泳、質(zhì)譜及酶聯(lián)免疫法（Enzymelinked Immune Sorbent Assay，ELISA）等；基于牛羊乳脂肪酸組成差異的色譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等檢測方法；基于牛羊乳氨基酸及維生素差異的熒光光譜檢測方法；基于牛羊乳中DNA差異的聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）等分子生物學檢測方法。此外，最新的非線性化學指紋圖譜技術、電子鼻等應用，也為羊乳摻入牛乳檢測提供了可靠支持。

2．1 羊原料乳摻入牛乳檢測方法及其特點

羊原料乳摻入牛乳檢測方法主要有以下5 種。

2．1．1 普通PCR檢測方法

主要利用牛特異性引物與羊特異性引物進行雙重PCR檢測，再用瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結果[4]。

2．1．2 熒光定量PCR檢測方法

主要選取牛、羊線粒體基因的特異性引物，以新鮮牛、羊乳樣品提取模板DNA，建立了基于DNA結合染料的實時熒光定量PCR方法[4]。

2．1．3 免疫層析試紙法

主要以牛乳αs1-酪蛋白及牛乳β-乳球蛋白為檢測對象，制備兩者的特異性抗體，建立雙聯(lián)膠體金免疫層析試紙條，用于羊乳摻入牛乳檢測[5]。

2．1．4 間接ELISA定量檢測方法

主要以牛乳中β-酪蛋白作為抗原產(chǎn)生多克隆抗體，并對抗體加以修飾，建立適合現(xiàn)場快速檢測的羊乳中摻入牛乳含量的ELISA方法[6]。

2．1．5 高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法

主要利用不同種類乳中乳清蛋白的保留時間不同，定性分析乳的種類，根據(jù)峰面積進行定量檢測其含量，可檢出至少10%的牛乳摻入[7]。

2．2 檢測方法及其特點

羊乳制品摻入牛乳檢測方法主要有以下4 種。

2．2．1 離子交換色譜法

以離子交換為基礎結合液相色譜快速分析不同種類乳制品中的蛋白，離子交換后的酪蛋白可以與免疫學法ELISA相結合，對乳及乳制品進行鑒定[7]。

2．2．2 基于毛細管電泳的乳蛋白摻假檢測方法

利用毛細管區(qū)帶電泳檢測羊乳產(chǎn)品中摻入的牛乳成分，其中牛乳的定性和定量檢測依據(jù)乳中是否存在特異性乳清蛋白，電泳檢測峰具有很高的分辨率，最小檢出量在乳混合物中體積分數(shù)為2%，在乳酪中體積分數(shù)為4%[8]。

2．2．3 等電點聚焦法

歐盟推薦鑒別非牛乳乳制品中含有牛乳的方法，主要用血纖維蛋白溶酶對乳及乳制品中的β-酪蛋白水解，對其水解產(chǎn)物γ2-酪蛋白和γ3-酪蛋白標記，并檢測這兩種酪蛋白的等電點值，根據(jù)等電點值大小檢測不同種類的乳源成分[7]。

2．2．4 ELISA法

可以用來鑒別摻有乳源成分的羊乳及羊乳制品，如摻有牛乳的綿羊和山羊乳酪（檢測限為0.1%～1%牛乳）[9]。

3 羊乳摻入牛乳檢測方法比較

目前，羊乳摻入牛乳檢測方法手段多樣且繁雜，但主要分為兩大類，即短時間（0.5～1.5 h）檢測法和長時間（1.5～5.0 h）檢測法。通過比較這兩大類方法的檢測時間、準確度和成本，對主要牛羊乳摻假檢測方法進行簡要歸類和分析。

3．1 羊乳摻入牛乳檢測方法時間比較

3．1．1 短時間牛羊乳混摻檢測方法

（1） 膠體金免疫層析技術

薛海燕等[5]以牛乳αs1-酪蛋白及牛乳β-乳球蛋白作為膠體金免疫層析中所應用的抗原，制備相應多克隆抗體，利用該技術制備的試紙條進行檢測，檢測時間僅需5～15 min，即可通過顏色變化來判斷羊乳中是否摻有牛乳。

（2）電子鼻

電子鼻方法鑒定羊乳摻假是主要的短時間檢測方法，測定時間40 min以內(nèi)。賈茹等[10]利用電子鼻結合化學計量法對羊乳中的蛋白質(zhì)摻假進行定性和定量研究，鑒定時電子鼻在25 ℃平衡30 min，然后進行測量，檢測時設定樣品準備時間5 s，檢測時間60 s，測量計數(shù)1 s，自動調(diào)零時間10 s，清洗時間5 min。金嫘等[11]通過電子鼻系統(tǒng)檢測在羊乳中摻入不同比例的牛乳混合物中揮發(fā)性物質(zhì)響應值，發(fā)現(xiàn)對于生乳和巴氏殺菌乳主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）和線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）均能夠區(qū)分羊乳中混入的不同比例牛乳，具有較好的區(qū)分性。鑒定時樣品于20 ℃平衡5 min，電子鼻測定條件為傳感器清洗時間5 min，傳感器歸零時間10 s，樣品準備時間5 s，每次分析用時1 min左右。

（3）HPLC

HPLC法鑒別牛羊乳混摻的時間也較短，為0.5～1.5 h。李寶寶等[12]建立了一種以β—胡蘿卜素的含量作為特征指標，通過HPLC檢測羊乳中摻入牛乳的定量分析方法，前處理皂化、離心約1 h，色譜分析約30 min，可準確的定量檢測羊乳中摻入牛乳的比例。杜晞等[13]采用電泳和高效液相色譜聯(lián)用檢測水牛乳中摻入的普通牛乳，該方法分析了兩種乳的乳清，方法需要樣品少，分離效果好，易定性，分析時間短（30 min內(nèi)），且聚丙烯酰胺凝膠電泳方法能檢測到摻入1%的牛乳。

（4）ELISA

由于檢測形式不同，ELISA法鑒別牛羊乳混摻的時間差異比較大，一般在1.5 h以內(nèi)，偶有超過1.5 h。薛海燕等[6]以牛乳中β-牛酪蛋白作為抗原產(chǎn)生多克隆抗體，并對抗體加以修飾，建立了適合現(xiàn)場快速檢測的羊乳中摻入牛乳含量的ELISA方法，除樣品預處理需要30 min外，其余檢測步驟可在10 min左右完成。依據(jù)ELISA法檢測原理，德國R-Biopharm公司研發(fā)出的系列檢測試劑盒及快速檢測條可供生產(chǎn)中快速檢測羊乳摻假[14]，其中原料乳檢測用時90 min、乳制品（酸乳、乳酪等）檢測用時150 min、快速檢測條5 min，檢出限分別為0.1%牛乳、0.5%牛酪蛋白及0.5%牛乳成分。

3．1．2 長時間牛羊乳混摻檢測方法

（1）PCR等分子生物學技術

PCR等分子生物學技術方法檢測牛羊乳混摻的時間需要3～5 h。宋宏新等[4]根據(jù)牛、羊的線粒體12S rRNA基因?qū)谢蛟O計合成兩對特異性引物，建立了羊乳中摻入牛乳的雙重PCR檢測方法，此過程提取DNA預處理約1 h，之后采用檢測試劑盒快速法用時10 min、磁珠法1.5 h，再進行PCR擴增35 min，擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，30～60 min，EB染色30 min，滅菌雙蒸水脫色10 min，最終置凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結果。建立基于染料的實時熒光PCR法對羊乳制品中牛乳成分進行摻假鑒別檢測，該過程中脫脂樣品制備1.5 h，DNA提取20 min，熒光定量PCR反應20 min，瓊脂糖凝膠電泳1 h。

（2）非線性化學指紋圖譜

利用非線性化學指紋圖譜法檢測牛羊乳混摻消耗的整體時間較長，樊成等[15]通過對牛、羊乳建立的非線性化學指紋圖譜各個參數(shù)進行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)兩類圖譜的誘導時間和最高電位時間具有極其顯著差異，此方法需要1.5～3.0 h可獲得結果。魯利利等[16]以非線性電化學指紋圖譜技術鑒別羊乳和牛乳及其產(chǎn)地，通過指紋圖譜直觀特征鑒別羊乳和牛乳，圖譜用時為1.5～3.0 h。薛建龍[17]通過氣質(zhì)聯(lián)用技術建立指紋圖譜對牛羊乳及其制品的脂肪酸組分進行分析測定，發(fā)現(xiàn)癸酸是二者差異最大的脂肪酸，整體耗時3～4 h。

3．2 羊乳摻入牛乳檢測方法準確度的比較

3．2．1 短時間快速處理方法準確度分析

（1）膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術是一種較為簡便、快速的技術。薛海燕等[5]以牛乳αs1-酪蛋白及牛乳β-乳球蛋白為檢測對象，用于快速檢測羊乳中摻入的牛乳，用試紙條檢測樣品結果顯示，當牛乳摻入量為5%時試紙條即顯色，但牛乳摻入量低于5%時不顯色，故試紙條的最低檢測限為5%。趙芳等[18]以牛免疫球蛋白G為檢測對象，建立了檢測羊乳中牛乳成分的競爭免疫層析法，可以檢測出含有2%牛乳的羊乳，受基質(zhì)干擾較小。

（2）電子鼻

電子鼻系統(tǒng)是一種新型的快速檢測手段，廣泛應用于現(xiàn)場在線檢測羊乳摻假。賈茹等[10]利用電子鼻結合化學計量法對羊乳中的蛋白質(zhì)摻假進行定性和定量的研究，采用PCA和LCA都能區(qū)分樣品摻假，線性回歸分析的決定系數(shù)為84.5%，線性判別分析的原始分類正確率達到100.0%、交叉驗證正確率為98.2%，K-最鄰近值分析對訓練集的分類正確率達到95.1%、對驗證集分類正確率為97.1%。

（3）HPLC

HPLC的應用在鑒別牛羊乳混摻方面也有較高的準確度。李寶寶等[12]利用牛乳中β-胡蘿卜素含量遠高于羊乳的原理，建立了一種以β-胡蘿卜素含量為特征指標的HPLC檢測牛羊乳混摻的定量分析方法，以β-胡蘿卜素為指標的樣品加標回收率為89.46%～98.19%，相對標準偏差為1.50%～2.79%，牛、羊乳中β-胡蘿卜素含量范圍分別為0.08～0.13 μg/g和1.9×10-3～2.2×10-3μg/g，線性相關系數(shù)為0.9958～0.9988，盲樣驗證的相對誤差為2.20%～4.75%。

（4）ELISA

ELISA在檢測牛羊乳混摻方面有著多樣的形式，準確度也有所差異。薛海燕等[6]利用間接ELISA方法，以β-酪蛋白作為基礎檢測羊乳中摻牛乳，得到最低檢出限為4%，方法變異系數(shù)＜5%，回收率在94%～105%之間。Beer等[19]利用牛乳中β-乳球蛋白和γ-酪蛋白與羊乳中含量的差異，檢測出山羊和綿羊乳酪中添加有0.1%的牛乳。張世偉等[20]采用制備抗牛免疫球蛋白G多克隆抗體和高特異性單克隆抗體，構建雙抗夾心ELISA方法，靈敏度為0.1 μg/mL，添加回收率在95%～105%之間，相對標準偏差小于12%。

3．2．2 長時間處理方法準確度分析

（1）PCR等分子生物學技術

基于DNA的PCR檢測技術有較強特異性[21～23]，目前已有較多羊乳中摻入牛乳的PCR檢測方法，且都有較高的準確性。黎穎等[24]分別對羊乳中摻入牛乳和水牛乳的檢測方法進行研究，在羊乳及其制品中摻入牛乳的檢測限為1%，在巴氏殺菌羊乳、高溫殺菌液態(tài)乳和干酪中的檢測限為5%，在酸乳中的檢測限為10%。利用PCR方法對羊乳制品中牛乳成分的摻假進行鑒別檢測，宋宏新等[4]可定量檢出新鮮羊乳中摻入2.5%的牛乳成分，基于磁珠法提取DNA的PCR檢測方法檢測限達1%。Liao等[22]實現(xiàn)了普通PCR和定量PCR對羊奶粉中摻入牛奶粉的定性、定量檢測，檢測限為0.1%。

（2）非線性化學指紋圖譜技術

非線性化學指紋圖譜技術作為一種對樣本進行整體綜合分析的新方法，準確度較高。王二丹等[25]利用非線性化學指紋圖譜信息回歸法測定了多種混合乳標樣中摻雜牛乳的含量，得到各種牛乳含量測定結果的相對標準偏差≤2.1%，回收率為97.3%～102%，方法重現(xiàn)性好、準確度高。魯利利等[16]利用非線性電化學指紋圖譜技術對羊乳和牛乳及其產(chǎn)地進行鑒別區(qū)分，結果表明，不同產(chǎn)地的羊乳或牛乳可利用系統(tǒng)相似度模式識別，用系統(tǒng)相似度模式鑒別乳制品產(chǎn)地的準確度≥91.9%，平均準確度達到94.3%；鑒別乳制品種類的準確度≥94.6%，平均準確度達到98.5%。樊成等[15]通過統(tǒng)計學分析方法從鮮乳的非線性化學指紋圖譜的諸多參數(shù)中篩選出牛羊乳之間具有差異的4 項參數(shù)指標，其中停振時間和最大振幅具有顯著差異，而誘導時間和最高電位時間則具有極顯著的差異，得到的牛羊乳含量比值與最高電位時間具有很好的數(shù)學回歸方程，經(jīng)R2檢驗方程合理可靠。

3．3羊乳摻入牛乳檢測方法成本的比較

在時間基本相同的情況下，電子鼻、HPLC和ELISA三種較為快速的處理檢測方法的檢測成本稍有區(qū)別。電子鼻作為新興儀器設備擁有較低廉的檢測價格，相較于色譜儀器，具有響應時間短、檢測速度快、相對成本較低，不需前處理試劑等優(yōu)點，但其應用主要集中在實驗室階段，有待解決的主要問題有設備成本高、取樣濃縮裝置大等。HPLC檢測牛乳中殘留物質(zhì)具有快速、精密度高、檢測限低和多聯(lián)檢測等優(yōu)點，其進樣體積小、分離快、溶劑消耗少，可節(jié)約檢測樣品，減少消耗成本[26]，但設備及其配置費用高昂、體積較大、移動性差，對樣品檢測時需要進行繁瑣的預處理，因此難以應用于實際工業(yè)生產(chǎn)。ELISA在當前羊乳摻假檢測中有著廣泛的應用，屬于半定量檢測方法，雖然會受到免疫法特異性抗體難以制備的制約，但此方法快捷、靈敏、特異性強，不需要進行反復處理，而且成本相對較低。

4 小結

本文通過簡述羊乳中摻入牛乳的鑒別方法，并從檢測時間、檢測精確度、檢測成本3 個方面對鑒別方法進行比較。

在短時間快速檢測方面，電子鼻檢測系統(tǒng)、免疫層析試紙條以及依據(jù)ELISA制成的檢測盒，由于較為低廉的成本、較快的檢測速度（30～60 min），有著較高的準確度——最低檢測線在4%～5%，基本適用于在生產(chǎn)中批量定性檢測羊乳中是否摻雜有牛乳。非線性化學指紋圖譜技術和高效液相色譜法、氣液質(zhì)譜聯(lián)用等已經(jīng)比較成熟的傳統(tǒng)儀器分析方法，都需要大型儀器以及較為嚴苛的操作條件和繁瑣的前處理，適宜少量樣本實驗室的分析鑒別，雖然非線性指紋圖譜耗時更長，但是在摻假鑒別方面擁有更高得準確度（96%～98%），且具有分析樣品產(chǎn)地的功能。PCR檢測方法是基于DNA檢測的技術，擁有高特異性、高靈敏度的特點，其在羊乳及其制品摻入牛乳的檢測限能達到0.1%的摻入檢測比例，但是該方法有較長的前期準備和處理時間，不適宜快速檢測。上述摻假檢測方法可為進一步完善乳制品安全檢測技術體系和保障乳制品市場的規(guī)范性提供參考和借鑒。