中草藥有效成分提取工藝及毒害成分檢測方法研究進(jìn)展

趙立春，李紅，劉繼永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特種動植物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，長春 130112）

中草藥是中醫(yī)防治疾病、養(yǎng)生保健的獨(dú)特藥物，可分為中藥和草藥，其本質(zhì)皆是來源于自然界的天然植物、動物和礦物質(zhì)以及人為生產(chǎn)的生物材料和仿生物質(zhì)。在我國，中草藥發(fā)展歷史悠久，體系較為完善，已形成一種獨(dú)特中草藥文化[1]，自神農(nóng)氏嘗百草以來，歷經(jīng)千年，經(jīng)久不衰，備受世人追崇。

隨著科技進(jìn)步和醫(yī)療保健事業(yè)發(fā)展，中草藥已不僅僅只局限于醫(yī)藥，同時涉及食品、保健、美容、飲料、化工等多個領(lǐng)域，市場價值巨大，需求量逐年增多。由于中草藥應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)大，其質(zhì)量也倍受關(guān)注。陳昌孝等[2]提出“中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）”這一中藥產(chǎn)品質(zhì)量新概念，旨在為中藥及其制劑產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)問題提供更加全面的研討方法，確保其質(zhì)量符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

當(dāng)今，中草藥質(zhì)量評價主要是對其真實(shí)性、質(zhì)量和安全性進(jìn)行評價[3]。一是鑒別其真?zhèn)?，從外觀特性進(jìn)行鑒定評價，這是最基礎(chǔ)，也是最重要的；二是評價質(zhì)量好壞，運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)設(shè)備檢測分析中草藥中功能成分的含量，以此來評價其質(zhì)量好壞；三是判斷其安全性，通過提取分離以及分析測試等手段，檢測有毒、有害成分（農(nóng)藥、重金屬殘留等）含量是否在規(guī)定的安全范圍內(nèi)。

1 外觀質(zhì)量評價

外觀質(zhì)量是由專業(yè)鑒定機(jī)構(gòu)或部門依據(jù)其形狀、顯微特征等對其感官品質(zhì)鑒定，判斷其真假、等級。即其生產(chǎn)必須參照中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）種植管理規(guī)范生產(chǎn)；形狀特征也必須按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）要求進(jìn)行鑒定評價研究[4]；顯微特征符合道地藥材的主要特征，符合中國藥典現(xiàn)行規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[5]。

2 有效成分提取分離

有效成分含量高低是中草藥質(zhì)量的重要指標(biāo)。中草藥藥理活性成分多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有效成分主要有生物堿、苷類、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、多糖、有機(jī)酸及其脂、蛋白質(zhì)、含氮化合物等[6]。對中草藥有效成分提取是中藥生產(chǎn)企業(yè)必要的工藝技術(shù)，從提取工藝發(fā)展歷程來看，可將其大致分為早期、近現(xiàn)代和現(xiàn)代3個時期。

2.1 早期提取工藝

早期提取方法及裝置都較為簡單，是在基于溫度等條件下，利用目標(biāo)成分與溶劑相似相容的原理進(jìn)行提取。根據(jù)提取物不同，提取劑有水、酸、堿、有機(jī)溶劑等。水作為提取溶劑，在適宜的條件下，以強(qiáng)穿透性、強(qiáng)極性的特點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)大部分化學(xué)成分提取，其效率較高、使用安全、污染較低。酸堿作為提取溶劑能夠破壞細(xì)胞壁，將大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)，達(dá)到提取的目的，但是會對大部分化學(xué)成分產(chǎn)生破壞。有機(jī)試劑（甲醇、乙醇等）則是以其低沸點(diǎn)、強(qiáng)穿透性的特性達(dá)到提取目標(biāo)成分的目的。

2.1.1 煎煮法 煎煮法是沿用至今的最早的中草藥提取方法，在高溫、長時間、多次煎煮條件下，以水作提取溶劑，提取易溶于水且耐高溫的有效成分，其提取成本低、無污染。陳阿麗等[7]對采用煎煮法提取人參皂苷的工藝進(jìn)行了研究，在8倍量沸水、60min/次、煎煮2次的條件下提取人參皂苷效率達(dá)到最高。

2.1.2 浸漬法 浸漬法是在適宜的溫度條件下，將中草藥浸泡在相應(yīng)的提取溶劑中，提取目標(biāo)成分。此法影響因素較少，方法較簡便。張春紅等[8]以水作提取溶劑，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化人參總皂苷提取工藝，結(jié)果表明，在10倍量水、60℃、浸提2 h的條件下，人參總皂苷的提取率最高。王亞萍等[9]報(bào)道，以浸漬法提取胡黃連浸膏的最佳提取工藝為20目粒徑、25倍量水、80 ℃、75 min。

2.1.3 回流法 回流法是以有機(jī)溶劑作為提取溶劑，通過加熱，蒸汽上升入冷凝管再回流，循環(huán)反復(fù)，直到目標(biāo)成分提取完全，其具體提取條件因溶劑不同而不同。在回流法提取人參皂苷試驗(yàn)中，研究者經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在6倍量70%乙醇、80℃、45 min/次、回流6次的條件下，可獲得最佳提取率[10]。

2.1.4 索氏提取法 索氏提取法是在回流法基礎(chǔ)上，采用索氏提取器虹吸原理提取材料中目標(biāo)成分。馮淼等[11]采用索氏提取法提取蘆薈中蘆薈苷，并利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選出其提取工藝為液料比1∶10、70%乙醇提取12 h，最大提取率達(dá)到了1.22 mg/g。吳月娜等[12]采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對青天葵中總游離氨基酸的提取工藝進(jìn)行篩選，20倍量水作溶劑、40℃浸提1 h，提取率最高。此方法對總皂苷、多糖的提取率較高、方法簡便、裝置簡單，但是耗時較長，無法實(shí)現(xiàn)多樣品同時處理。

2.1.5 水解法 水解法是氨基酸提取最常用的方法，以一定濃度強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶液，在一定溫度下水解蛋白質(zhì)，釋放氨基酸，其方法主要有酸水解法、堿水解法、氧化水解法[13-14]。蛋白質(zhì)的酸、堿水解法結(jié)果有所不同，各有其側(cè)重點(diǎn)，堿水解時色氨酸不被破壞，但易發(fā)生外消旋作用，水解物中存在D-型和L-型2類氨基酸；酸水解則不會發(fā)生外消旋作用，水解物中只有L-型氨基酸，但色氨酸幾乎全部被破壞；過甲酸氧化法是在酸水解之前進(jìn)行過甲酸氧化，以達(dá)到保護(hù)胱氨酸的目的。

2.2 近現(xiàn)代時期

伴隨著科技不斷發(fā)展，新型儀器和多重原理綜合使用，提取方法極大地提高了提取效率，降低了生產(chǎn)成本。

2.2.1 表面活性劑法 表面活性劑法是根據(jù)提取物具有表面活性，通過通氣或攪拌產(chǎn)生氣泡，使其吸附于氣泡上，從而實(shí)現(xiàn)分離，方法簡單、提取率較高。Xiu等[15]采用表面活性劑法分離濃縮了Rb1、Rb2等5種人參皂苷。張海濱等[16]對表面活性劑法提取竹節(jié)參總皂苷的工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在氣泡直徑0.4～0.5mm、溫度65℃、pH 5.5、電解質(zhì)0.015mol/LNaCl的條件下，其總皂苷富集比為2.1，純度比為2.6，回收率98.33%，回收率較高，方法穩(wěn)定。

2.2.2 微波輔助萃取法 微波技術(shù)的應(yīng)用，顯著提高了目標(biāo)成分提取率。微波直接作用于化學(xué)物質(zhì)，對較弱化學(xué)鍵起到斷鍵、重組作用；同時，高能量可使細(xì)胞內(nèi)溫度快速上升，破壞原組織結(jié)構(gòu)，加大了固液接觸面積，加速提取過程。微波輔助萃取技術(shù)具有提取率高、耗能低、耗時短、更為環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在中草藥化學(xué)成分提取過程中被廣泛應(yīng)用[17-22]，但該方法在操作過程中較難控制，產(chǎn)生的能量較大，易產(chǎn)生爆沸現(xiàn)象。

2.2.3 超聲輔助提取法 超聲波產(chǎn)生震動、空化、攪拌等綜合性作用，增加固液接觸面積，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分高效、快速提取[23]。季曉暉[24]對超聲輔助提取人參皂苷的工藝進(jìn)行研究，結(jié)果表明，以20倍量甲醇作溶劑、45℃、頻率45 kHz、時間60 min，其提取效率最高。該方法耗時較短、裝置簡單、成本較低，適用于多糖、皂苷及農(nóng)殘等大分子物質(zhì)提取和分離。

2.2.4 高壓與超高壓提取法 高壓與超高壓提取法是利用流體靜壓驟減作用，使中草藥細(xì)胞璧膜透化，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)成分快速提取的目的，該方法作用時間較短，不受溫度條件制約，可用于中草藥中熱不穩(wěn)定成分提取。陳瑞戰(zhàn)等[25]采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對利用超高壓提取人參皂苷工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，以75倍量50%乙醇作提取溶劑、提取壓500 MPa、提取時間2 min時，其提取率最高。

2.2.5 超臨界流體萃取法 超臨界流體與液體相似，其粘度低、擴(kuò)散性強(qiáng)。超臨界流體萃取法利用流體成分具有較強(qiáng)滲透與溶解力，通過調(diào)節(jié)流體溫度和壓力來調(diào)節(jié)目標(biāo)成分溶解度，從而高效提取或分離目標(biāo)成分，可作為超臨界流體成分有CO2、乙烯、丙烯、乙烷、甲醇、乙醇等[26]。顏雪琴等[27]在進(jìn)行超臨界CO2萃取石榴皮原花青素工藝的研究中發(fā)現(xiàn)，以1.2倍量65%乙醇作提取劑、提取壓力35 MPa、提取溫度48℃、提取時間58 min時，提取率達(dá)到最高。

2.3 現(xiàn)代提取方法

2.3.1 半仿生提取法 半仿生提取是一種新興提取技術(shù)。利用“灰思維方式”，在體外模擬口服給藥及藥物經(jīng)腸胃轉(zhuǎn)化吸收原理，通過控制pH達(dá)到提取目的，能夠保留較多有效成分。陳新等[28]研究發(fā)現(xiàn)，對于人參皂苷提取，仿生提取法明顯高于水提取法，而且其提取物質(zhì)對于食用者所帶來的異物感較低，更容易被吸收利用。李欽青等[29]利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片的半仿生提取工藝，最終得到以12倍量水、60℃溫度下提取2 h，其各項(xiàng)指標(biāo)提取率最高。

2.3.2 脈沖電場提取法 脈沖電場提取是利用細(xì)胞膜電穿孔原理，瞬間使膜電位發(fā)生改變，破壞細(xì)胞壁膜，從而來實(shí)現(xiàn)對其細(xì)胞中各組分的提取，具有耗時短、耗能低、產(chǎn)物不易變性等優(yōu)點(diǎn)，但是起步晚，裝置過于簡單，仍處于發(fā)展階段[30]。

2.3.3 基質(zhì)固相分散提取法 基質(zhì)固相分散提取法是將樣品與固相萃取劑混合研磨，使其充分混勻，然后置于萃取柱中，采用合適洗脫劑進(jìn)行洗脫、分離，提取樣品中組分。王志冰等[31]利用基質(zhì)固相分散技術(shù)提取冬蟲夏草、丹參和蜂膠中活性成分，其方法與溶劑提取法相比，明顯減少提取溶劑使用量，提取效率較高，方法簡便。但是自填裝柱子的穩(wěn)定性較難控制，有較大誤差，很難保證實(shí)驗(yàn)條件的完全統(tǒng)一。

2.3.4 生物提取法 生物提取法即酶提取法。生物酶能夠溶解細(xì)胞內(nèi)的壁膜結(jié)構(gòu)，釋放成分，同時根據(jù)酶高度專一、降低反應(yīng)活化能的特性，以達(dá)到降低反應(yīng)時間、提高反應(yīng)效率的目的。該方法所需條件嚴(yán)苛，溫度、pH等條件必須適宜才能保證效率；由于酶具有專一性，需綜合酶共同作用，提取目標(biāo)成分[32]。由于該方法中間產(chǎn)物較多，水解不夠徹底，成本較高，此方法不常用。

有效成分提取時所得到的提取物成分復(fù)雜，為獲得準(zhǔn)確的目標(biāo)成分，需進(jìn)一步分離純化。常用的方法有固-液分離法[33]和液-液分離法，按化學(xué)成分分配比例的不同來萃取目標(biāo)成分，如高速逆流色譜法[34]和離心分配色譜法[35]、離子交換法[36]、活性炭層析法[37]、分級沉淀法[38]、柱色譜分離技術(shù)[39]和膜分離技術(shù)[40]等。

3 毒害成分提取

由于受天氣、土壤、水源及其他生物因素的影響，在中草藥生長過程中極易受有害因素影響，導(dǎo)致毒害成分（農(nóng)藥殘留、重金屬等）含量嚴(yán)重超標(biāo)，不但加大后期中草藥及其制劑加工成本，還對使用者的安全產(chǎn)生極大威脅。所以，安全因素指標(biāo)也是中草藥質(zhì)量組成因素。

3.1 農(nóng)藥殘留 農(nóng)藥濫用，滯留量增多且分解較慢，導(dǎo)致殘留量嚴(yán)重超標(biāo)，極大威脅食用者安全。農(nóng)藥殘留問題嚴(yán)重制約著行業(yè)的安全與發(fā)展，對于農(nóng)殘分析至關(guān)重要，一般可分為提取-凈化-檢測三大步驟[41]。

農(nóng)藥殘留分析通常采用水溶性溶劑提取-非水溶性溶劑再分配-固相吸附柱凈化-氣相或液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合檢測[42]。農(nóng)藥殘留提取與純化至關(guān)重要，不僅關(guān)系著結(jié)果準(zhǔn)確性，還影響著檢測儀器的使用壽命。農(nóng)藥殘留提取、分離凈化方法與有效成分的提取方法相同，只是在其提取劑與凈化物質(zhì)方面會根據(jù)農(nóng)藥種類不同而有所差異[43-44]。

3.2 重金屬 比重大于5的金屬易與人體內(nèi)蛋白質(zhì)和酶發(fā)生強(qiáng)烈作用，使其失活，也會在某些器官內(nèi)產(chǎn)生積累，造成慢性中毒。重金屬檢測已經(jīng)成為衡量中草藥安全性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，其檢測前處理方法眾多，有干法灰化法、濕式消解法、微波消解法。

3.2.1 干法灰化法 干法灰化法是指在特定裝置內(nèi)，經(jīng)高溫分解、灰化，殘?jiān)儆萌軇┤芙鈾z測?？煞譃檠跗咳紵ê透邷鼗一?。前者在有氧密閉條件下燃燒有機(jī)樣品，適用于有機(jī)物中鹵素、磷、氯、溴等元素檢測[45]；后者置于坩堝等裝置中，在通氣下，高溫分解，常用于測定重金屬鉛、鎘、鉻等元素檢測[46]。

3.2.2 濕式消解法 濕式消解法是在樣品中加入適量強(qiáng)氧化酸或混合酸（HNO3－HClO4、HNO3－HClO4－H2SO4、HNO3－H2SO4、H2SO4－H2O2和HNO3－H2O2等）加熱消解，必要時加入催化劑加速反應(yīng)[47]。當(dāng)樣品含有較多無機(jī)物時，多采用含鹽酸混合酸進(jìn)行消解；當(dāng)樣品含硅酸鹽時，則用氫氟酸消解。與干法灰化法相比較，裝置簡單、耗時短，但不適合消解油脂含量較高的樣品。

3.2.3 微波消解法 微波消解法是將各種酸、部分堿以及鹽類與樣品混合，在高溫增壓下，利用微波加熱使樣品快速溶解消化。其原理是微波電磁場能夠使極性分子由隨機(jī)分布轉(zhuǎn)向按電場分布，在高頻電場作用下快速旋轉(zhuǎn)、遷移、摩擦，從而提高溫度，激發(fā)分子旋轉(zhuǎn)振動，促進(jìn)樣品消解[48]。裝置操作簡便、耗時較短，但不適于進(jìn)行大批量操作。

4 總結(jié)與展望

中草藥質(zhì)量直接影響著其藥效發(fā)揮和安全。當(dāng)今市場，對中草藥質(zhì)量安全要求越來越高，研究評價體系亦不斷在完善。但是，在化學(xué)成分提取前處理時所采用試劑、儀器等材料造價較高，且工序繁瑣、耗時較長等嚴(yán)重制約著體系發(fā)展。隨著中草藥質(zhì)量關(guān)注度與日俱增，提取分離技術(shù)趨向低成本、無污染、簡便高效、自動化方向發(fā)展。本文旨在總結(jié)經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，為構(gòu)建更加合理、準(zhǔn)確、快速、高效、低成本的提取分離方法提供理論支持，提高中草藥及其制劑品質(zhì)與效益。