高效液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥學(xué)研究中的應(yīng)用

杜光光，王佳，李婷，劉繼華

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130021）

高效液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/QTOFMS）是一種結(jié)合了超高效液相的高分離能力和四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜的高分辨及功能的新型技術(shù)，它不僅可以對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，且其在全掃描范圍內(nèi)都具有很高的靈敏度，為微量成分的快速鑒定提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。目前，已廣泛應(yīng)用于藥學(xué)、化學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的研究，使化合物結(jié)構(gòu)分析工作進(jìn)入新時(shí)代，推動(dòng)了科學(xué)的進(jìn)步。本文主要綜述了超高效液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥學(xué)研究中有關(guān)藥物結(jié)構(gòu)鑒定、藥物代謝及生物大分子研究方面的應(yīng)用。

1 在藥物結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用

藥物結(jié)構(gòu)總的來(lái)說(shuō)包括藥物有效成分的結(jié)構(gòu)、藥物中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，超高效液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與其他的分析方法相比，具有效率高、速度快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在藥物結(jié)構(gòu)鑒定中具有重要意義。

1.1 在中藥活性成分鑒別中的應(yīng)用

在檢測(cè)樣品量少的情況下，用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器結(jié)合四級(jí)桿飛行時(shí)間檢測(cè)器檢測(cè)技術(shù)，比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時(shí)間，紫外吸收光譜和質(zhì)譜中的分子離子峰和具有特征性的碎片峰來(lái)鑒別藥物活性成分結(jié)構(gòu)。韓彥琪等[1]利用超高效液相色譜-四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q/TOF）技術(shù)分析出了玫瑰花抗炎癥的活性成分為食子酸、4-O-沒(méi)食子酰基奎寧酸、沒(méi)食子酸甲酯等7種有效活性成分，為玫瑰花抗炎作用的闡述和抗炎機(jī)制研究提供了參考。卞振華等[2]利用UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)分析五味子的體外抑菌活性組分，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜提供的相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜高能量碰撞碎片信息，初步鑒定了11個(gè)化合物，分別為奎尼酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸異構(gòu)體、咖啡酰奎尼酸、莽草酸、檸檬酸單甲酯、原兒茶酸、富馬酸單乙酯、2-羥基-丙基三羧酸-2-乙酯和檸檬酸二甲酯；該試驗(yàn)初步篩選了五味子抑菌活性部位，為開(kāi)發(fā)天然抑菌制劑提供了方法和思路。賴麗嫦等[3]通過(guò)高效液相色譜串聯(lián)-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（HPLC-Q-TOF-MS）鑒定廣金錢(qián)草中主要活性成分41種，其中包括37個(gè)黃酮類成分、4個(gè)酚酸類成分；通過(guò)HPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)，為闡明廣金錢(qián)草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。施樹(shù)云等[4]建立DPPH-HPLC-QTOF-MS/MS方法快速篩選、鑒定和檢測(cè)杜仲黑茶中抗氧化活性成分，確定抗氧化活性成分為沒(méi)食子酸、新綠原酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、槲皮素-3-O-桑布雙糖苷、蘆丁和異槲皮苷，所建立的方法無(wú)須繁瑣的分離純化過(guò)程，可快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量篩選復(fù)雜體系中的抗氧化活性成分，并為杜仲黑茶的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

有的藥物中含有的有效成分不是單一組分，而是由多種化合物共同組成的，在這種情況下清楚地知道每一種化合物的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)對(duì)研究該藥物的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)尤為重要。宋玉梅等[5]建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF-MS）測(cè)定銀黃顆粒中活性成分的定性和定量分析方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)其中14個(gè)化合物得到了鑒定，12個(gè)化合物通過(guò)與對(duì)照品比較，保留時(shí)間、精確分子量和多級(jí)質(zhì)譜信息得到了結(jié)構(gòu)確證，可見(jiàn)此分析方法可有效用于銀黃顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制。刁義平[6]采用超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法對(duì)復(fù)方紫靈膠囊中化學(xué)成分進(jìn)行分析，共鑒定出30個(gè)化合物，該方法對(duì)復(fù)方紫靈膠囊的成分鑒定提供了一種快速準(zhǔn)確的分析方法。

王輝俊等[7]采用UPLC/ESI-QTOF-MS法鑒定瓜蔞皮注射液中化學(xué)成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正負(fù)離子模式下，共鑒別出瓜蔞皮注射液化學(xué)成分19個(gè)，包括7個(gè)氨基酸、4個(gè)核苷酸、5個(gè)黃酮、1個(gè)多肽、1個(gè)唾液酸和1個(gè)含氮化合物，此分析方法為闡明瓜蔞皮注射液的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。游飛祥等[8]運(yùn)用高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-Q-TOF/MS）對(duì)六經(jīng)頭痛片中的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，通過(guò)質(zhì)譜裂解規(guī)律結(jié)合自建的8味組方藥材的化學(xué)成分庫(kù)信息，共鑒定出95個(gè)化合物，主要包括異黃酮類、香豆素類、環(huán)烯醚萜類和苯酞類等成分，并對(duì)化合物的藥材來(lái)源進(jìn)行了歸屬，采用HPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)比較全面地闡明了六經(jīng)頭痛片的化學(xué)組成，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制提供了參考。束艷等[9]采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）對(duì)中藥柔肝膠囊（丹參、姜黃等）中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，結(jié)果表明，通過(guò)Q-TOF/MS正、負(fù)離子質(zhì)譜信息及元素組成分析并結(jié)合對(duì)照品與相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照，共鑒定出19個(gè)化合物，主要結(jié)構(gòu)類型為水溶性酚酸類、姜黃素類、皂苷類及異黃酮類化合物。李穎等[10]通過(guò)超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)定性分析水飛薊素膠囊中的化學(xué)成分，然后結(jié)合參考文獻(xiàn)和對(duì)照品信息，共鑒定化合物15個(gè)，包括二氫黃酮化合物1個(gè)、黃酮醇化合物2個(gè)、二氫黃酮醇化合物3個(gè)、黃酮木脂素類9個(gè)，此分析方法對(duì)水飛薊素膠囊的成分進(jìn)行定性分析，為其質(zhì)量控制及藥效機(jī)制的闡明提供科學(xué)依據(jù)。

1.2 在復(fù)雜成分篩選中的應(yīng)用

在所服用的藥物中，大多數(shù)藥物的化學(xué)成分、作用機(jī)制、代謝途徑都被研究得很清楚，但也有一些成分復(fù)雜的藥物對(duì)它的成分組成、起效機(jī)制、活性成分和代謝途徑了解得不夠透徹，這就嚴(yán)重阻礙了此類藥物的發(fā)展，所以，找到一種合理的分析方法去分析這種藥物顯得尤為重要，而UPLC/QTOF-MS聯(lián)用分析技術(shù)就以其特有優(yōu)點(diǎn)在藥物復(fù)雜成分篩選方面被廣泛應(yīng)用。Bringmann等[11]采用HPLC/QTOF-MS分析技術(shù)檢測(cè)了熱帶葛藤類植物提取物的化學(xué)組成成分，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的天然產(chǎn)物，并確證其結(jié)構(gòu)和構(gòu)型。Wolfender等[12]采用UPLC/QTOF-MS技術(shù)檢驗(yàn)了龍膽科、豆科的多種植物，結(jié)果表明，在樣品很微量的情況下也能快速且準(zhǔn)確地對(duì)具有生物活性的化合物進(jìn)行分離與鑒別，用此方法分析蘿摩科三酚丹主要活性成分為菲吲哚里西丁類生物堿；首先分離得到3種骨架10個(gè)菲吲哚里西丁類生物堿，在此基礎(chǔ)上用HPLC-MS技術(shù)對(duì)有效部位進(jìn)行了考察，分析檢測(cè)到11個(gè)微量的菲吲哚里西丁類生物堿成分，通過(guò)參照單體化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，分析推測(cè)了一些微量成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。鄭偉等[13]采用UPLC/QTOF-MS技術(shù)分離和鑒定知母粗提物中的甾體皂苷，在正、負(fù)極MSE掃描模式下，最終鑒定出了67個(gè)甾體皂苷，包括16個(gè)同分異構(gòu)體、14個(gè)新甾體皂苷化合物。

1.3 在藥物雜質(zhì)分析中的應(yīng)用

高效液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜連用技術(shù)是藥物雜質(zhì)分析中的常用技術(shù)之一，HPLC/QTOF-MS技術(shù)可以隨時(shí)檢測(cè)藥物合成過(guò)程中的中間體、副產(chǎn)物或降解產(chǎn)物，具有卓越的靈敏度、高選擇性和快速的特點(diǎn)，已經(jīng)成為藥物中雜質(zhì)分析和結(jié)構(gòu)鑒定的首選。楊偉峰等[14]利用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)奧替拉西鉀中主要雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)推定，并且分析其來(lái)源，結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)奧替拉西鉀及其主要雜質(zhì)的一級(jí)與二級(jí)高分辨質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，推定主要雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)為1,3,5-三嗪-2,4-（1氫,3氫）-二酮和2-（3-氨基甲酰脲基）-2-羰基乙酸，2個(gè)主要雜質(zhì)均由奧替拉西鉀降解得到。潘芳芳等[15]采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法分析頭孢拉定中主要雜質(zhì)并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，通過(guò)四極桿-飛行時(shí)間二級(jí)質(zhì)譜圖特征碎片的分析確定了頭孢拉定中1.32%的未知雜質(zhì)為雙氫頭孢拉定，同時(shí)推測(cè)該雜質(zhì)可能是中間體雙氫苯甘氨酸中的雜質(zhì)（四氫苯甘氨酸）參與合成引進(jìn)的；該方法鑒定了頭孢拉定中的1個(gè)未知雜質(zhì)，進(jìn)而可以對(duì)藥品雜質(zhì)控制和工藝優(yōu)化提供參數(shù)。朱培曦等[16]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)尼群地平原料藥中的2個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行在線的質(zhì)譜分析，直接推斷出了2個(gè)雜質(zhì)可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)，檢測(cè)結(jié)果對(duì)于尼群地平原料藥的雜質(zhì)分析、質(zhì)量控制和合成工藝的改進(jìn)具有重要作用。候曉蓉等[17]利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)醋氯芬酸中的主要雜質(zhì)進(jìn)行鑒別，檢測(cè)出其主要雜質(zhì)為雙氯芬酸乙酯、醋氯芬酸乙酯、醋氯芬酸叔丁酯3種，此方法可作為醋氯芬酸原料藥的質(zhì)控方法。胡楚楚等[18]采用HPLC/QTOF-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)西尼地平的主要光降解雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，通過(guò)比對(duì)合成雜質(zhì)和光降解雜質(zhì)的紫外光譜、液相色譜保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)一步確認(rèn)該光降解雜質(zhì)為西尼地平Z-異構(gòu)體；并同時(shí)確認(rèn)西尼地平片及膠囊的光降解雜質(zhì)均為西尼地平Z-異構(gòu)體，該研究對(duì)西尼地平及其制劑雜質(zhì)分析、質(zhì)量控制具有參考作用。

2 在藥物體內(nèi)代謝研究中的應(yīng)用

藥物體內(nèi)代謝研究是當(dāng)今藥學(xué)領(lǐng)域研究最多、發(fā)展速度最快的研究領(lǐng)域，它是通過(guò)分析人和動(dòng)物體液及各組織器官中藥物及其代謝物濃度，了解藥物在體內(nèi)數(shù)量和質(zhì)量的變化，獲得藥物代謝動(dòng)力學(xué)的各種參數(shù)和轉(zhuǎn)變以及代謝的方式、途徑等信息，從而有助于藥物的研究、臨床合理應(yīng)用等。

喬湜等[19]采用UHPLC/QTOF-MS技術(shù)分析鑒定止咳寶片在大鼠血漿中的代謝產(chǎn)物，鑒定出了5個(gè)阿片類生物堿、甘草苷和甘草酸及其相關(guān)代謝產(chǎn)物31個(gè)；5種阿片類生物堿、甘草苷和甘草酸在大鼠體內(nèi)的代謝途徑包括葡萄糖醛酸化、硫酸化、脫甲基化、脫氨基甲基后羧基化、水解等。程宇欣等[20]采用UHPLC/QTOF-MS技術(shù)鑒定吳茱萸水提物在大鼠血漿、尿液及糞便中的代謝產(chǎn)物，通過(guò)分析各成分的保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息并與相應(yīng)的對(duì)照品比對(duì)，得到吳茱萸水提物在大鼠血漿、尿液和糞便中代謝產(chǎn)物35個(gè)，吳茱萸水提物在大鼠體內(nèi)代謝的主要途徑有羥基化、氫化、甲基化、硫酸化、葡糖醛酸化等。蘇聯(lián)麟等[21]采用UHPLC/QTOF-MS技術(shù)對(duì)生、醋五味子醇提物在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中代謝過(guò)程進(jìn)行分析，得出生、醋五味子醇提物在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生去甲基化、羥基化、氧化等代謝轉(zhuǎn)化，最終在生、醋五味子組中共鑒定出6種木脂素原形成分及它們的20種代謝產(chǎn)物。高家榮等[22]運(yùn)用UPLC/QTOF-MS技術(shù)對(duì)丹蛭降糖膠囊防治2型糖尿病血管病變大鼠進(jìn)行血清代謝組學(xué)研究，結(jié)果，丹蛭降糖膠囊可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，防治2型糖尿病血管病變，其作用機(jī)制可能在于調(diào)節(jié)氨基酸代謝、膽汁酸和脂代謝以及氧化應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)。徐靜靜等[23]采用UPLC/QTOF-MS法分析并鑒定鹽酸丁咯地爾在人血漿和肝微粒體孵化體系中的代謝產(chǎn)物，通過(guò)與空白生物樣品進(jìn)行比較，在人血漿和肝微粒體中共發(fā)現(xiàn)了丁咯地爾及其24種代謝產(chǎn)物，其中18種為首次發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物，闡明了丁咯地爾在人體的代謝途徑，包括去甲基化、氧化、羥基化、硫酸和葡萄糖醛酸結(jié)合途徑。

3 在生物大分子研究中的應(yīng)用

隨著醫(yī)藥研究技術(shù)的發(fā)展，人類治療疾病的藥物也不再局限于化藥和天然藥物，生物制劑開(kāi)始逐漸走進(jìn)藥學(xué)領(lǐng)域的研究，而生物大分子藥物（多肽、蛋白質(zhì)、抗體、聚糖與核酸）也以其高效、低毒的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、艾滋病、心腦血管病、肝炎等重大疾病中，但生物大分子藥物的使用方面也有一些未解決的難題和障礙，如難以透過(guò)細(xì)胞膜、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分離純化困難、穩(wěn)定性低等一系列問(wèn)題，因此，對(duì)生物大分子藥物的研究更為重要。高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為一種有效的分析方法在此領(lǐng)域得到應(yīng)用。Henry等[24]應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）對(duì)單克隆抗體（曲妥珠單抗，人源化單克隆免疫球蛋白IgG1）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深度表征，結(jié)果表明，應(yīng)用LC/MS對(duì)曲妥珠單抗的完整蛋白及其亞基（輕鏈和重鏈）的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定得到良好的質(zhì)量準(zhǔn)確度，由此可判定特定蛋白修飾在輕鏈和重鏈上的分布；通過(guò)對(duì)曲妥珠單抗酶解后的氨基酸全序列確認(rèn)，可對(duì)其翻譯后修飾以及可能的錯(cuò)誤氨基酸序列進(jìn)行解析。李響等[25]通過(guò)胰蛋白酶酶解蛋白，PNGase F去除多肽混合物中糖肽的糖基化，將去糖后的總肽用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，經(jīng)液相分離后，通過(guò)LC-ESI-Q-TOF完成了融合蛋白FP3的76%氨基酸序列測(cè)定，通過(guò)LC-ESI-Trap完成余下24%氨基酸序列測(cè)定。賴瑋毅等[26]用反相離子對(duì)色譜串聯(lián)電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜的方法，以乙酸銨為離子對(duì)試劑，用于檢測(cè)固相合成的寡核苷酸的純度以及酶活性試驗(yàn)中寡核苷酸分子量的變化，檢測(cè)了帶有5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）的RNA寡核苷酸經(jīng)tet蛋白催化氧化前后的樣品，成功檢測(cè)到了底物5mC RNA寡核苷酸及其氧化產(chǎn)物 5羥甲基胞嘧啶RNA寡核苷酸的多電荷峰，證明了 tet蛋白不僅對(duì)DNA中的5mC有催化氧化作用，對(duì)RNA中的5mC也有催化活性。

4 結(jié)論

HPLC/QTOF-MS的出現(xiàn)，改變了人們對(duì)以前傳統(tǒng)藥物分析的認(rèn)知，讓相關(guān)人員對(duì)藥物的分析更加快捷、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，大大減少了藥物分析工作人員的工作量，使藥物分析工作效率變得更高，極大地加快了人類在藥學(xué)領(lǐng)域前進(jìn)的步伐，使更多的新藥產(chǎn)品得以問(wèn)世，解決了更多的疑難雜癥。目前HPLC/QTOF-MS技術(shù)在藥物分析方面分析范圍廣、特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度很高，對(duì)一些珍貴藥物只需微量即可檢測(cè)；HPLC-MS連用儀器有多種數(shù)據(jù)處理軟件和工具，極大地方便對(duì)數(shù)據(jù)的分析。在互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)大時(shí)代，天然藥物、化藥和生物制藥的數(shù)據(jù)庫(kù)不斷擴(kuò)充，藥物中的各類化學(xué)成分的指紋圖譜不斷建立，高效液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)?huì)不斷擴(kuò)大，對(duì)科學(xué)領(lǐng)域做出的貢獻(xiàn)也會(huì)越來(lái)越多。