FMR1基因CGG重復序列多態(tài)性與不明原因早期自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究

馮旺琴，陳素文*，武淑英，陳雁鳴

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院計劃生育科，北京 100026；2. 北京大學第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100083)

流產(chǎn)分為早期流產(chǎn)和晚期流產(chǎn)，在所有臨床確認的妊娠中，約10%～15%會發(fā)生早期自然流產(chǎn)[1]。自然流產(chǎn)的病因較復雜，包括內(nèi)分泌功能異常、解剖學因素、遺傳學因素、免疫學因素、感染性疾病、父母雙方高齡及其他未知因素[2]。近年來，自然流產(chǎn)的發(fā)病率逐年升高，嚴重影響了女性的生殖健康和心理健康，其具體發(fā)病機制仍不十分清楚，目前認為遺傳因素在其中發(fā)揮了重要作用[3]。脆性X智力障礙1號基因(FMR1)的5’端非編碼區(qū)有一個不穩(wěn)定的CGG三核苷酸串聯(lián)重復序列，該基因又稱家族性智力低下基因，位于染色體Xq27.3處，1991年由荷蘭科學家Verkerk等[4]發(fā)現(xiàn)，當FMR1基因5’端非編碼區(qū)CGG重復序列異常擴增時，其蛋白產(chǎn)物FMRP(主要在大腦和睪丸組織中表達)顯著減少，當擴增達到200 bp以上，往往伴隨著超甲基化，最終使得新生兒缺乏FMRP，引起智力障礙[5]。

國內(nèi)外不同種族人群FMR1基因CGG重復序列多態(tài)性存在差異，我國尚未見到該基因大樣本育齡女性的數(shù)據(jù)。自然流產(chǎn)夫婦FMR1基因CGG重復序列多態(tài)性是否高于普通人群，需要進一步研究。本研究通過回顧性分析探討不明原因早期自然流產(chǎn)與FMR1基因CGG重復序列多態(tài)性變異程度之間的關(guān)系，為自然流產(chǎn)的病因?qū)W研究及臨床診療提供參考，也為自然流產(chǎn)患者再次妊娠前進行遺傳咨詢提供指導。

資料與方法

一、研究對象

研究對象包括自然流產(chǎn)組與對照組。

收集2015年5月1日至2018年4月1日期間在首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院計劃生育科就診的患者，難免流產(chǎn)或超聲檢查發(fā)現(xiàn)胚胎停育(未見胎心搏動、無胚芽等)需要清宮終止妊娠的孕婦，一共2 000例，為自然流產(chǎn)組，發(fā)生1次及1次以上不明原因的自然流產(chǎn)，年齡20～46歲。排除標準：生殖道畸形、全身性感染、外力撞擊、負重等因素。

收集同期在北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科就診的1 480例順利分娩正常新生兒的女性為對照組，年齡23～45歲。

自然流產(chǎn)組和對照組均為漢族。所有研究對象均自愿進行該項檢查，并簽署知情同意書。

二、實驗方法

所有研究對象于孕早期或孕中期進行FMR1基因檢測。抽取研究對象外周靜脈血2 ml，以Magen全血DNA提取試劑盒(Magen，美國)提取基因組DNA，利用脆性X-FMR1基因Amplide X檢測技術(shù)(Asuragen，美國)進行CGG重復序列數(shù)檢測。反應體系為三引物(FMR1上、下游引物、上游CGG引物各0.5 μl)進行PCR擴增，擴增條件按試劑盒說明書要求設(shè)置。

詳細記錄本實驗所有研究對象的各項資料，結(jié)合FMR1基因突變篩查所得結(jié)果，對相關(guān)數(shù)據(jù)以及研究對象的各種臨床資料進行比較分析。采用目前國內(nèi)外普遍采用的分類：(1)正常重復范圍(n=5～44次)；(2)中間型(intermediate)或者灰區(qū)(gray zone)(n=45～54次)；(3)前突變(premutation)(n=55～200次)；(4)全突變(full mutation)(n>200次)[6]。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、患者一般情況比較

自然流產(chǎn)組孕周5～12周，平均(8.6±2.2)周。其中孕周<9周的1 035例，孕周≥9周的965例。初次自然流產(chǎn)1 337例，復發(fā)性流產(chǎn)(流產(chǎn)次數(shù)≥2次)663例。孕次1～6次，產(chǎn)次0～1次。孕婦年齡>35歲998例，年齡≤35歲1 002例，平均年齡(31.5±3.3)歲。

對照組平均年齡(30.8±3.2)歲，孕次1～7次，產(chǎn)次1～3次；孕婦年齡>35歲678例，年齡≤35歲802例。兩組病例年齡比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

二、兩組CGG重復序列分布規(guī)律比較

自然流產(chǎn)組患者FMR1基因檢測及統(tǒng)計結(jié)果顯示：CGG重復最大頻率等位基因n=30，其次為29，再其次為36和31。對照組最大頻率等位基因n=30，其次依次是29、36和31，兩者高度一致。自然流產(chǎn)組檢測到35種不同的等位基因，CGG重復次數(shù)變異范圍n=21～133，最大頻率等位基因為n=30(659/2 000，32.95%)，其后依次是n=29(623/2 000，31.15%)、36(312/2 000，15.60%)、31(117/2 000，5.85%)。對照組檢測得到25種不同的等位基因，CGG重復次數(shù)變異范圍n=22～58，最大頻率等位基因n=30(492/1 480，33.24%)，其后依次是n=29(377/1 480，25.47%)、36(218/1 480，14.73%)、31(124/1 480，8.38%)。自然流產(chǎn)組及對照組CGG重復均數(shù)分別為(29.33±5.19)、(28.73±6.37)次，二者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組FMR1基因CGG重復序列分布比較[n(%)]

本研究將中間型(灰色區(qū)域)CGG重復次數(shù)擴增范圍定為45～54，檢出自然流產(chǎn)組FMR1基因的中間型患者9例，F(xiàn)MR1基因中間型攜帶率為1∶222；對照組中FMR1基因的中間型6例，F(xiàn)MR1基因中間型攜帶率為1∶247。二者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

自然流產(chǎn)組中FMR1基因前突變(PM)攜帶者5例，攜帶者的頻率1∶400。對照組中前突變攜帶者2例，攜帶者的頻率1∶740。二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

所有病例均未發(fā)現(xiàn)FMR1全突變基因(>200 CGG)。

討 論

自然流產(chǎn)是一種較為常見的妊娠并發(fā)癥，可能與染色體異常、免疫因素、遺傳因素等有關(guān)，但臨床上仍有約50%的患者病因不明確。

脆性X綜合征，是一種常見的遺傳性智力低下疾病，其致病基因為脆性智力障礙基因。FMR1基因CGG重復次數(shù)的變化與臨床意義緊密相關(guān)，根據(jù)不同的擴增概率，目前國內(nèi)外普遍采用美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會的建議，將CGG重復序列分為4類，第1類“正?！?，表明未受累型，CGG重復數(shù)5～44之間，一般情況下未受累人群傳代過程中CGG重復序列穩(wěn)定，其后代不會因為CGG擴增的原因?qū)е麓嘈訶綜合征，因此受檢者不必進行產(chǎn)前診斷[3]；第2類中間區(qū)域，或者“灰區(qū)”，重復數(shù)45～54次之間，受檢者本身沒有臨床癥狀，其后代也不會因為CGG的擴增導致脆性X綜合征，可不建議進行產(chǎn)前診斷，但后代有可能擴增成為攜帶者，可以檢測其后代的FMR1基因；第3類，“前突變”序列，55～200次之間，即突變攜帶者，后代有很大的擴增風險，因此需要進行產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢；第4類，“全突變”序列，CGG重復數(shù)>200次，為完全突變型，大約50%的女性為脆性X綜合征患者，50%可能沒有癥狀，需要進行產(chǎn)前診斷[6-8]。

本研究樣本發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)組和對照組頻率最高的CGG重復數(shù)都是30、29，其次為36、31。國內(nèi)張有成等[9]報道頻率最高的CGG重復數(shù)是29個CGG重復，其次為30和31個CGG重復，再其次為36和37個CGG重復。與本研究高度一致。巫向前等[10]報道FMR1等位基因在漢族人群中沒有區(qū)域差異，最常見的重復數(shù)為29，其次為36。劉帆等[11]研究報道烏魯木齊市漢族育齡女性的FMR1基因中最常見的CGG重復數(shù)為29(41.33%)，其次為30(28.06%)。馬云等[12]研究漢族和壯族人群的最大峰值分別為28和29，序列范圍為6～43，其中CGG重復序列范圍主要為27～30。本研究與國內(nèi)報道基本相符。

自然流產(chǎn)組FMR1基因的灰色區(qū)域患者9例，F(xiàn)MR1基因灰色區(qū)域攜帶率為1∶222，對照組灰色區(qū)域攜帶者6例，攜帶率為1∶274，均為漢族育齡女性。劉帆等[11]報道烏魯木齊市漢族育齡女性FMR1基因突變灰色區(qū)域攜帶率為1∶98，高于本研究結(jié)果。自然流產(chǎn)組脆性X綜合征前突變攜帶者5例，攜帶者的頻率1∶400。Lu等[13]對122例卵巢早衰漢族女性進行檢測，前突變攜帶率1∶122，高于本研究病例。美國研究結(jié)果顯示FMR1基因CGG重復序列的女性全突變患病率報道范圍為1∶8 000到1∶2 500，中間型(n=45～54)發(fā)病率為1∶66，明顯高于本研究的1∶222和1∶247；前突變(n=55～200)的攜帶率為1∶113到1∶382[8，14-15]，與本研究自然流產(chǎn)組的1∶400接近，明顯高于本研究對照組的攜帶率1∶740。

中國臺灣地區(qū)、韓國開展了FMR1基因CGG重復序列檢測的相關(guān)研究。韓國進行的FMR1基因回顧性研究結(jié)果顯示前突變的患病率為1∶788，中間型(n=45～54次)的攜帶率為1∶137[16]，顯著低于西歐等其他國家的報道。也低于本研究自然流產(chǎn)組前突變的攜帶率，但與對照組基本一致。中國臺灣地區(qū)開展的脆性X綜合征相關(guān)新生兒篩查研究估計該地區(qū)的發(fā)病率為1∶10 046[17]，也明顯低于非亞洲地區(qū)的發(fā)病率報道。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1基因前突變與卵巢早衰之間具有顯著相關(guān)性，前突變患者卵巢早衰發(fā)病率高達13%，自然絕經(jīng)時間較早，有關(guān)卵巢儲備功能相關(guān)的指標：血清抗苗勒管激素、基礎(chǔ)FSH水平等出現(xiàn)異常[18-19]。對于前突變攜帶者女性，建議進行遺傳咨詢，同時進行產(chǎn)前診斷，隨著年齡增長，卵巢儲備功能下降，絕經(jīng)可能提前，卵細胞質(zhì)量下降，導致妊娠丟失，推遲生育可能不是一個好的選擇[20-22]。美國婦產(chǎn)科學院建議存在風險的女性在40歲之前進行基因突變篩查，前突變攜帶者風險增高，需要評估卵巢儲備功能，如基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)或者卵巢儲備功能，建議患者在卵巢功能下降之前懷孕，以避免妊娠的丟失。隨著目前我國二胎的全面開放，二胎生育年齡明顯推遲，高齡尤其40歲以上的女性希望生育二胎比例明顯增加，對我國高齡女性進行基因突變篩查同樣重要。

本研究發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)組FMR1基因的前突變型攜帶比例顯著高于對照組，其原因尚不明確。提示FMR1基因CGG重復序列前突變與不明原因早期自然流產(chǎn)可能存在相關(guān)性。Kline等[23-24]曾推測流產(chǎn)的增加可能與卵巢卵母細胞池的減少有關(guān)，F(xiàn)MR1基因的前突變攜帶者，卵巢儲備功能下降，二者之間可能存在某種關(guān)聯(lián)。本試驗尚未對所有研究對象的卵巢儲備功能相關(guān)指標進行對比研究，后續(xù)研究需進一步完善。

對所篩查出的FMR1前突變基因攜帶者的臨床特點進行分析，發(fā)現(xiàn)5例患者有3例有2次自然流產(chǎn)史，2例1次自然流產(chǎn)史，等位基因n=62、70、81、83、133，均尚未分娩。對照組2例前突變攜帶者，分娩時年齡為29歲、32歲，等位基因均為n=58，其中1例第1次足月分娩，另1例為二胎，曾有1次人工流產(chǎn)史，均無不良孕產(chǎn)史，新生兒均正常。Strom等[25]進行了119 232例脆性X綜合征檢測和307例產(chǎn)前檢查，發(fā)現(xiàn)1.7%FMR1基因前突變，當胎兒遺傳了一個擴大的母體等位基因，對于<50、50～75、76～100、>100重復序列的等位基因，擴展到一個完整的受影響的等位基因的風險分別是0%、5%、30%和100%。這些數(shù)據(jù)有利于攜帶者的遺傳咨詢和脆性X綜合征的產(chǎn)前診斷。CGG重復區(qū)域內(nèi)AGG插入位置和數(shù)量，被認為是在子代傳遞傳過程中，有利于減少擴增為全突變的可能性[26]。

女性攜帶者在傳代過程中易發(fā)生CGG重復序列的進一步擴展，發(fā)病風險呈逐代遞增趨勢。對于中間型的等位基因，在子代傳遞中的擴增風險尚缺乏有力依據(jù)，給孕婦或孕前的女性提供遺傳咨詢時，要考慮到在子代傳遞過程中重復序列的不穩(wěn)定性。前突變患者應告知子代傳遞中有明確的擴增為全突變的風險，并根據(jù)風險概率向前突變攜帶者提供合理的生育建議[27]。對于攜帶者，進行產(chǎn)前風險評估做出合理的生育計劃，告知生育的可能性和途徑，獲得成功的生殖結(jié)局[28]。部分脆性X綜合征患者外周血中的CGG重復狀況不能取代其他組織中的情況，遺傳檢測和咨詢環(huán)節(jié)一定要注意FMR1基因CGG重復序列的組織異質(zhì)性。檢測中應明確CGG重復數(shù)目、AGG插入模式和FMR1甲基化情況3個重要因素，以此評估個人致病風險及生殖傳遞過程中的風險。本研究僅對外周血CGG重復序列進行研究，有一定局限性，需要進一步完善。

本研究認為FMR1基因CGG重復序列位于中間型及以上的婦女應引起產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢的足夠重視。Saul等[29]對美國南卡羅來納州出生后的1 459例新生兒進行了測試，獲得了5個異常結(jié)果，包括1個性染色體非整倍體(47，XXY)、2個前突變和2個全突變，脆性X綜合征檢測率為1∶730，對新生兒的篩查有潛在的可行性，但評估、人口效益尚不能用于常規(guī)篩查。Hill等[30]對新生兒和妊娠前或妊娠期間的育齡婦女進行脆性X綜合征的人群系統(tǒng)篩查，發(fā)現(xiàn)除了醫(yī)學問題，更要注意篩查者的心理問題和教育支持，避免過度的焦慮和失望。

后續(xù)我們?nèi)孕柽M行大規(guī)模的研究，了解中國育齡女性人群中FMR1基因突變的特點、其與臨床表型的關(guān)系以及對子代的影響，對其進行針對性的遺傳咨詢及指導，篩查潛在高危因素的孕婦，以提升脆性X綜合征的產(chǎn)前檢出率，達到優(yōu)生優(yōu)育。這些數(shù)據(jù)資料也為篩選中國人群中脆性X綜合征的患者和攜帶者提供了依據(jù)。