間充質(zhì)干細胞在宮腔粘連及其他子宮內(nèi)膜損傷治療方面的研究進展

林慧隆，沈來恩，林琪，邊曉麗，吳雪清

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，溫州 325000)

宮腔粘連(IUA)第一次是由德國的Fritsch在1894 年報道的，但在1948年，Asherman首次對該疾病進行命名并作詳細描述，因此現(xiàn)在也稱之為Asherman綜合癥(AS)[1]。其主要是由于子宮內(nèi)膜基底層損傷后修復(fù)障礙而導(dǎo)致的宮腔部分或全部粘連閉塞，從而引起月經(jīng)異常、周期性腹痛、不孕及反復(fù)流產(chǎn)等臨床表現(xiàn)。從組織學(xué)角度來說，IUA就是內(nèi)膜基質(zhì)被纖維組織替代，腺體被不活躍的柱狀上皮替代，后者對激素刺激不敏感。最終子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致了子宮功能失常。在起初的50～60年，對宮腔粘連的研究主要集中在其流行病學(xué)、病因?qū)W和病理學(xué)。內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展為其診斷和治療提供了新的手段，目前以宮腔鏡下粘連分解術(shù)并輔以雌激素治療作為標準治療手段[2]。Myers等[3]報道了一篇案例，12位重度宮腔粘連的女性在宮腔鏡粘連分解術(shù)后輔以雌激素、球囊支架、宮內(nèi)節(jié)育器(IUD)綜合治療后全部恢復(fù)了月經(jīng)周期，并且其中6人成功妊娠。但宮腔粘連術(shù)后總體復(fù)發(fā)率為 3.1%～23.5%，其中重度粘連高達 62.5%[4]。對于重度宮腔粘連子宮內(nèi)膜大面積損傷的情況下，雌激素很難達到有效的治療作用，因為雌激素發(fā)揮作用必須在足夠殘留內(nèi)膜的基礎(chǔ)之上。而干細胞工程為宮腔粘連的治療開辟了一條新的道路，以往的研究已經(jīng)證明了其能通過促進子宮內(nèi)膜再生來治療宮腔粘連[5-7]。但是大樣本數(shù)據(jù)的缺乏使得無法形成標準化的干細胞治療方案。為普及宮腔粘連的干細胞治療，一系列的問題有待解決，比如干細胞來源問題、劑量選擇、用藥方式等。

一、宮腔粘連概述

子宮內(nèi)膜可以分為功能層和基底層。生理情況下，功能層在卵巢周期性的激素作用下可發(fā)生增生、分化及脫落，再由基底層按周期規(guī)律性再生成新的功能層。正常女性生育期可經(jīng)歷400多個這樣的周期，表明子宮內(nèi)膜具有再生能力以及較強的容受性。而病理狀態(tài)下，基底層修復(fù)功能受損時，子宮內(nèi)膜完整性被破壞，導(dǎo)致宮腔發(fā)生形態(tài)異常及纖維粘連的形成。其形成機制可能為雌激素受體減少、子宮內(nèi)膜干/祖細胞異常、細胞因子異常和血管形成障礙等幾方面共同作用[8]。

二、干細胞治療子宮內(nèi)膜效果的評價指標

為了解子宮內(nèi)膜修復(fù)效果，在動物實驗中已經(jīng)形成了一系列較為常用的檢查。其中包括病理形態(tài)學(xué)結(jié)果(如子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜腺體數(shù)目、子宮內(nèi)膜小血管數(shù)目及纖維化面積比率等)、免疫熒光檢測(觀察經(jīng)標記的干細胞在內(nèi)膜分布情況)、免疫組織化學(xué)檢測(如角蛋白、波形蛋白及轉(zhuǎn)化生長因子的檢測等)、IUA相關(guān)基因檢測以及子宮妊娠結(jié)局(如胚胎數(shù)目等)。

三、不同來源的干細胞治療宮腔粘連

(一)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)

1.臨床案例：國內(nèi)外案例報道主要集中在自體骨髓間充質(zhì)細胞的移植治療上。Nagori等[5]的團隊報道了一例將自體提取的干細胞移植到子宮腔治療重癥宮腔粘連的患者，他們從該患者自身骨髓細胞中分離出39×106個CD9、CD40、CD90陽性細胞移植至子宮腔，最終患者子宮內(nèi)膜增厚達到胚胎移植的標準，并通過體外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功懷孕。而Singh等[6]則直接將(103.3±20.5)×106個單核干細胞(MNCs)直接移植到6名患者子宮內(nèi)膜下，而不是分離出特定表型的細胞再移植。結(jié)果顯示全部6名患者子宮內(nèi)膜厚度均較前增加，但未達到理想厚度，其中5名恢復(fù)了月經(jīng)。Santamaria等[7]從外周血中分離出CD133陽性的骨髓來源干細胞，平均數(shù)量為124.39×106個，再通過導(dǎo)管自體移植到子宮螺旋動脈中。經(jīng)過治療后，16個宮腔粘連及子宮內(nèi)膜萎縮患者中，15個恢復(fù)了月經(jīng)，其中1名患者成功經(jīng)陰道分娩足月兒，另一個則經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩足月兒。國內(nèi)Zhao等[9]將攜帶骨髓來源單核細胞的膠原支架放置到子宮腔來治療10個重度宮腔粘連患者，移植的干細胞密度為5×106/cm2，最終有5名患者成功生育。以上臨床案例皆是通過宮腔內(nèi)移植干細胞來進行治療，細胞數(shù)量、用藥途徑存在一定的差別，但宮腔粘連等損傷情況都在一定程度上得到改善。

2.動物實驗：Liu等[10]利用綠色熒光蛋白(GFP)標記BMDCs在子宮內(nèi)膜物理損傷后的C57BL/6J小鼠模型上進行試驗，分別通過靜脈血注射和宮腔局部注射的方式給予治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全身用藥的小鼠子宮內(nèi)募集了更多的GFP陽性的細胞。該實驗表明全身用藥具有更好的的治療效果，至少在保持損傷部位干細胞濃度上具有一定優(yōu)勢，其可能原因在于靜脈較宮腔具有更有利于干細胞生長的環(huán)境。但靜脈注射干細胞安全性及臨床可行性仍需要進一步進行探索。此外，該實驗也提示了能從提高局部干細胞的活性和濃度的方面入手提高干細胞移植的治療效果，如Yang等[11]就發(fā)現(xiàn)，在體外實驗中，維生素C(Vc)能促進Pluronic F-127(PF-127)凝膠包裹的BMSCs的生存及生長，并且在經(jīng)物理損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的宮腔粘連大鼠模型中證明了BMSCs、PF-127和Vc三者聯(lián)合治療能促進子宮內(nèi)膜修復(fù)，這表明Vc和PF-127能為BMSCs創(chuàng)造一個更有利的生存環(huán)境，提高其治療作用。而最近Ong等[12]指出并沒有證據(jù)表明BMDCs能轉(zhuǎn)化為子宮內(nèi)膜上皮、基質(zhì)細胞或者內(nèi)皮細胞，該團隊利用更靈敏的檢測手段來檢測子宮內(nèi)膜的免疫細胞的表型，他們推測之前關(guān)于BMDCs能轉(zhuǎn)化為子宮內(nèi)膜細胞系的報道其實是錯誤地識別了免疫細胞。這一發(fā)現(xiàn)是顛覆性的，因為人們普遍認為BMDCs能直接促進子宮內(nèi)膜再生，基于此才形成了一系列針對損傷內(nèi)膜的治療方法。因此，明確這個問題非常重要，未來需要更多的關(guān)注該方面研究進展。然而，不論是臨床還是動物實驗都表明BMDCs對于內(nèi)膜損傷具有一定的修復(fù)作用，且患者癥狀確實有改善。這也從側(cè)面表明干細胞的治療作用可能不是直接通過分化成為子宮內(nèi)膜細胞，而更多的是通過分泌的細胞因子起作用。

(二)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)細胞(eMSCs)

eMSCs作為一種多分化和高增殖潛能的干細胞，能夠像其他干細胞一樣被用于多種學(xué)科的再生醫(yī)學(xué)[13]。已經(jīng)有證據(jù)表明eMSCs能在體外轉(zhuǎn)化為內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細胞。同時，相對于健康對照組，宮腔粘連患者的內(nèi)膜組織中擁有較少的干細胞[14]。目前，能夠通過多種方法從月經(jīng)血中獲得此類干細胞，故又稱經(jīng)血干細胞[13，15-16]。其獲取的條件具有重復(fù)性和非侵襲性等優(yōu)點，是良好的間充質(zhì)干細胞來源。

1.臨床案例：除了BMSCs案例以外，臨床上也有利用eMSCs來治療7名重度宮腔粘連患者的報道。通過宮腔內(nèi)移植1×106個表現(xiàn)為CD44、CD73、CD90 和 CD105陽性的細胞，最終結(jié)果顯示其中的5名患者的子宮內(nèi)膜增厚達7～8 mm，1名自然懷孕，2名經(jīng)胚胎移植后成功懷孕[13]。

2.動物實驗：為探究eMSCs在子宮內(nèi)膜損傷疾病中的的治療機制，Zhang等[17]利用電凝的方式建立子宮內(nèi)膜損傷的小鼠模型，并通過靜脈注射的方式進行eMSCs移植。研究結(jié)果顯示接受移植的小鼠內(nèi)膜組織厚度及微血管密度相對于對照組均有增加，并且其妊娠結(jié)局也有改善。此外還發(fā)現(xiàn)源自干細胞的條件培養(yǎng)基能夠通過激活A(yù)KT和/或ERK通路減少H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡、促進內(nèi)皮細胞增殖和遷移能力并能促進新生血管形成。該團隊的另一項研究則在利用95%酒精沖洗宮腔的方式建立SD大鼠子宮內(nèi)膜纖維化模型，他們發(fā)現(xiàn)由eMSCs分泌的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)能夠通過抑制鋅指蛋白GLI2(Gli2)表達來減少內(nèi)膜的纖維化[18]。而在此之前，竺海燕[19]已經(jīng)通過細胞體外實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)血干細胞條件培養(yǎng)基能顯著促進eMSCs的增殖，并通過激活Hippo/TAZ通路、抑制轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)的方式減輕纖維化程度。

(三)脂肪組織來源間充質(zhì)細胞(aASCs)

盡管BMSCs是目前應(yīng)用最為廣泛的干細胞來源，但其創(chuàng)傷性的收集細胞過程反而加重了病人的痛苦，這點是不可避免的限制。而MSCs的獲取具有重復(fù)性和非侵襲性等優(yōu)點，是良好的BMSCs的替代品。脂肪干細胞有多種分化能力，已經(jīng)應(yīng)用很多領(lǐng)域，其易獲取性、倫理爭論小和較小的創(chuàng)傷性使之成為一個理想的干細胞來源。從脂肪提取物中分離而來的干細胞在體外能誘導(dǎo)分化成脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞以及肌細胞等[20]。ASCs的分化潛能和其他間充質(zhì)干細胞類似，且他們的分離的產(chǎn)量和培養(yǎng)時的增殖速率都要高于BMDCs[21]。針對ASCs的細胞表型分析發(fā)現(xiàn)這些細胞表達CD34、73、CD90以及CD105，不表達CD31、CD45[22]。其能分泌一些細胞因子，具有促血管生成、抑制免疫以及抗氧化的作用[23]。但ASCs是否能夠有效修復(fù)損傷的子宮內(nèi)膜、使之恢復(fù)正常生理狀態(tài)仍具有爭議。目前為止還未見有關(guān)脂肪來源干細胞治療宮腔粘連的案例報道。

動物實驗：Kilic等[24]將2×106個CD90、CD44和CD49表達陽性，而CD11b/c、CD45表達陰性的ASCs注射到三氯乙酸誘導(dǎo)的宮腔粘連大鼠的一側(cè)子宮角，之后連續(xù)3次腹腔內(nèi)注射，每次間隔5 d。結(jié)果顯示有4%～6%的經(jīng)標記的細胞在子宮組織被發(fā)現(xiàn)，同時還觀察到新生血管增多、纖維化面積減少。但在纖維化降低方面，單純干細胞治療組較對照組沒有統(tǒng)計學(xué)意義，反而單純雌激素和干細胞結(jié)合雌激素治療效果更加明顯。國內(nèi)的孔德勝[8]利用物理損傷和細菌脂多糖感染的雙重損傷法建立大鼠宮腔粘連模型，通過子宮肌壁間注射和復(fù)合小腸黏膜下基質(zhì)支架(SIS)的方式移植2×106大鼠ASCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純ASCs注射移植無明顯效果，只在后期發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜細胞上皮化優(yōu)于模型組，并且原位注射的宮角后期只可見少量經(jīng)綠色熒光標記的ASCs存活，至21 d時，只有極少量細胞存在。而SIS復(fù)合或不復(fù)合ASCs的方式不僅可以改善子宮內(nèi)膜的病理狀態(tài)指標，還可以提高子宮內(nèi)膜容受性，胚胎數(shù)目增加。此外，SIS復(fù)合ASCs治療效果較單純SIS治療組效果更佳[8]。這表明該種支架能有利于細胞的生存和生長，以此增加ASCs的治療效果。在這之前，Hunter等[25]就探索過脂肪來源間質(zhì)血管部分細胞(SVF)能否改善子宮內(nèi)膜形態(tài)和容受性。SVF主要成分是脂肪干細胞。他們利用無水酒精成功誘導(dǎo)形成了SD大鼠薄型子宮模型，并在此基礎(chǔ)上宮腔內(nèi)注射0.5 ml含有1×106細胞的懸液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮容受性的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上并未顯示有意義的改善，但降低了舒張微血管的緊張度，增加了組織流量。為檢測受體組織中的GFP陽性的SVF細胞分布情況，該團隊還進行了3D共焦成像，發(fā)現(xiàn)細胞植入不良，沒有陽性細胞存在。

雖然上述造模方式、給藥方式有些許差異，對實驗造成了一定的影響。但從總體來看，單純原位注射干細胞對于修復(fù)子宮內(nèi)膜效果不佳，其可能原因與干細胞的在宮腔內(nèi)的保留與植入能力有關(guān)。因此如何增強脂肪來源干細胞的活性及生存能力成了至關(guān)重要的問題。受上述實驗的啟發(fā)，筆者認為可以從增加給藥次數(shù)、延長給藥時間、用靜脈注射替代原位注射及聯(lián)合一些其他藥物共同治療等方面入手。近年，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院的魯峰教授團隊發(fā)明了一項新專利SVF-gel，即脂肪干細胞膠。其是通過物理方法有效去除脂肪組織中的油滴后，得到的富含脂肪干細胞和細胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)物，后者主要成分是膠原蛋白，彈性蛋白和粘多糖。相對于普通脂肪組織，其保留了大部分ECM，為脂肪干細胞提供了良好的生存環(huán)境，增加其生存率。已有實驗證明其在皮膚傷口愈合方面具有促進作用[26]。筆者認為其可能在未來能夠應(yīng)用于宮腔粘連等纖維化相關(guān)疾病的治療。

同時，在脂肪干細胞使用的安全性方面，有團隊嘗試在移植前對其進行γ射線輻射處理，減少其增殖能力，但仍保留了促進子宮內(nèi)膜再生的能力[27]，這一試驗也從一方面說明干細胞修復(fù)機制不完全依賴于自身的增殖分化，其還能夠分泌一些因子來產(chǎn)生作用。

(四)其他來源

除了上述幾種主要來源的干細胞以外，還有報道利用羊膜間充質(zhì)基質(zhì)細胞[28]、人早孕蛻膜間充質(zhì)干細胞[29]、臍帶間充質(zhì)干細胞[30]等探究干細胞對于宮腔粘連和子宮內(nèi)膜損傷的治療效果和機制。

四、小結(jié)

重度宮腔粘連的治療與預(yù)防復(fù)發(fā)目前仍是難點，而基于干細胞治療的再生醫(yī)學(xué)為其創(chuàng)造了條件。來源廣泛的干細胞為人們提供了多樣化的選擇，但同時，大樣本數(shù)據(jù)的缺乏使得無法形成標準化的干細胞治療方案，上述文獻中涉及的造模方式、用藥途徑和用藥劑量都存在一定差異，由此可能產(chǎn)生了不同、甚至相反的結(jié)局，以至于無法有效的進行分析比對，未來仍需進行大樣本的實驗。此外，單純移植干細胞的效果并不理想，可能原因在于移植的干細胞受宮腔內(nèi)環(huán)境影響無法產(chǎn)生定植、分泌的效果，因此如何在一段時間內(nèi)維持和增強細胞的生存和分泌作用需要進行更深入的研究。更為理想的治療方案是分離出有效的細胞因子代替干細胞對宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷進行治療，但更全面的機制仍需要進一步的探索。隨著研究的深入進行，基于間充質(zhì)干細胞的子宮內(nèi)膜修復(fù)和治療將會更加準確、有效。