米曲霉次生代謝產物真菌毒素研究進展

孫莉，胡文康，付彬，沈婉瑩，徐寧

(湖北工業(yè)大學 湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心，武漢 430068)

米曲霉(Aspergillusoryzae)屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、從梗孢科、曲霉屬，它的應用歷史悠久，早在我國周朝就開始用其釀造豆醬，隨后傳入日本、朝鮮等亞洲國家，當今也是亞洲發(fā)酵食品生產中使用的主要釀造真菌[1]。真菌在生長過程中會分泌大量的次生代謝產物，而這些代謝產物往往是具有有效的生理活性的低分子量物質，通過分子生物學、生物信息學和比較基因組學的研究，表明真菌次生代謝產物是由成簇的基因編碼的[2]。米曲霉基因組已被破譯，比同屬中重要的病原菌煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和工業(yè)發(fā)酵菌黑曲霉(Aspergillusnidulans)大25%～30%，因此米曲霉可能產生更豐富的次生代謝產物[3]。食品安全問題已經是一個全世界都關注的問題，其中真菌毒素引起的食品安全問題日益嚴重，這些毒素就來源于真菌代謝產生的次級產物。雖然米曲霉是目前世界上公認的安全食用菌種，但是隨著對米曲霉次生代謝產物的深入研究，發(fā)現(xiàn)其中存在少量種類的真菌毒素，存在潛在的食品安全危害，可能對人體健康造成危害[4]。本文綜述了米曲霉次生代謝產物真菌毒素的研究進展，有助于避免米曲霉真菌毒素可能引起的食品安全風險。

1 環(huán)匹阿尼酸

環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)是一種吲哚-六氫茚-吡咯烷類神經毒素(indole-hydrindane-tetramic acid neurotoxin)，分子式為C20H20N2O3，是曲霉屬次生代謝產生的真菌毒素之一[5]。CPA是由Holzapfel C W首次在青霉菌中分離得到的，并在1977年證實CPA存在于米曲霉中[6]。Yokota T等第一次從米曲霉中分離出CPA，并用蠶來證實其可以引發(fā)病變[7]。而后研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)食品釀造中使用的米曲霉并未代謝產生CPA，只在一些野生型米曲霉中有發(fā)現(xiàn)[8]。Hill J E等又利用小鼠實驗進一步證實了CPA的毒性作用[9]。CPA的毒性機理已研究得較為清晰，其毒性與黃曲霉素相當，主要是抑制了Ca2+-ATP酶，從而阻斷Ca2+的轉移，使得心肌收縮力減弱[10]。

米曲霉在固態(tài)培養(yǎng)和液態(tài)培養(yǎng)中均可生成CPA，但CPA的毒性往往因為與它同時存在的黃曲霉毒素而被人們忽視[11]。薄層色譜法是目前在真菌培養(yǎng)以及農產品中應用最普遍的CPA測定方法[12]。趙刪等[13]利用高效液相色譜法測定米曲霉中CPA的含量，所建立的方法快速、簡便、準確。Rodríguez A等研究出了實時定量PCR(qPCR)方法，對參與CPA生物合成的酶：二甲基烯丙基色氨酸合成酶設計特異性引物(dmaTF/dmaTR)，利用TaqMan探針(dmaTp)對dmaT編碼基因進行雜交，在不同的人工接種食物中評估qPCR方案量化CPA產生霉菌的能力，這種方法可以用來在HACCP監(jiān)管體系中防止整個食物鏈中CPA產生的風險[14]。以上方法為米曲霉真菌毒素CPA安全檢測提供了技術支持。

2 3-硝基丙酸

3-硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NPA)是一種由多種霉菌產生的具有神經毒性的真菌毒素[15]，分子式為C9H9NO4。第一次在米曲霉中發(fā)現(xiàn)并分離出來是由Nakamura S團隊完成的[16]，隨后Matsumoto H等對3-NPA結構的光譜學特征進行了分析和報道[17]。3-NPA是一種琥珀酸脫氫酶(SDH)抑制劑，它會在紋狀體中產生行為、生化和組織學變化，在動物和人類中引發(fā)亨廷頓病[18]。它產生的紋狀損傷是一種中樞神經系統(tǒng)中毒的表現(xiàn)，有多種生理反應例如嘔吐、眩暈、抽搐等，嚴重者還會導致死亡。還有相關報道指出3-NPA可能發(fā)生中毒，從而導致兒童延遲性肌張力障礙[19]。研究發(fā)現(xiàn)它會引起小鼠模仿年老老鼠的認知和運動的缺陷。Haine S， Kari M比較了生理鹽水和3-NPA(劑量為420 mg/kg)對小鼠的影響，使用迷宮和小鼠轉棒實驗(rotarod test)測試了運動協(xié)調性，結果顯示注射3-NPA比注射生理鹽水出現(xiàn)錯誤多很多[20]。研究還發(fā)現(xiàn)每4天向6～10周大的小鼠腹腔內注射劑量為10 mg/kg的3-NPA，連續(xù)28天便可以引起小鼠神經變性[21]。George A等對3-NPA進行了安全性評價，認為成人3-NPA的安全攝入量應不超過25 μg/kg·天[22]。3-NPA在米曲霉的固態(tài)和液態(tài)培養(yǎng)中均可以產生，但其毒性比CAP要弱。3-NPA檢測方法已經開發(fā)許多種，如Shao G J等開發(fā)利用固相萃取-離子色譜法測定甘蔗中的3-NPA；胡文娟等利用薄層色譜法檢測了甘蔗中3-NPA的含量；劉勇等[23]用液相色譜法和氣相色譜法檢測了動物血漿中的3-NPA含量；江濤等用液相色譜檢測方法測定了米曲霉菌培養(yǎng)物中3-NPA的含量[24]。

近年來，人們致力于抑制3-NPA毒性的研究，Jang M等研究發(fā)現(xiàn)1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥榭赡軙A防和改善3-NPA 誘導小鼠模型中亨廷頓病的神經損傷和紋狀細胞死亡[25]。Colle D等研究發(fā)現(xiàn)丁二醇可以通過負轉錄調控來預防3-NPA誘導的線粒體功能障礙和氧化應激(一種血管病變的重要病理過程)[26]。Calderón G D研究驗證了腦活素在治療3-NPA中毒的鼠腦中保護大腦免受自由基影響的假設[27]。 因此，人們對3-NPA的防治越來越完善。

3 麥芽米曲霉素

麥芽米曲霉素(maltoryzine) 是一種曲霉屬真菌毒素，分子式為C11H12O4，最早是由Iizuka H等從米曲霉發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)并分離出來，并發(fā)現(xiàn)它對小鼠有肌麻痹作用，腹膜下給藥IC50為3 mg/kg[28]。麥芽米曲霉素可能會對腦中樞神經具有損害，并有麻痹、飲食不進的風險，但目前尚未發(fā)現(xiàn)其具有致癌或基因致癌的作用。

Abdelghany T M等利用HPLC技術對黑曲霉中的麥芽米曲霉素進行純化和測定，具體方法是將黑曲霉分別接種在含有2%小麥粒的天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基(Czapek Dox)于250 mL錐形瓶中，每個瓶中含有40 mL調節(jié)至pH 6.5的培養(yǎng)基，并在(28±2) ℃下培養(yǎng)10天。再將分離出的培養(yǎng)物單獨混合，然后在真空下過濾除去生物質，用正丁醇萃取，并將有機溶劑在真空下蒸發(fā)至干燥，得到粗提取物。將5 g粗提取物溶于CH3OH(HPLC級)中。通過HPLC分離提取器，C18色譜柱(200 mm×4.6 mm×5 μm)進行檢測，流速為1 mL/min，流動相為80%甲醇水溶液。通過UV檢測器在波長215 nm處進行檢測。通過具有不同濃度的二甲雙胍A和C的標準曲線進行測定[29]。

此方法為米曲霉中的麥芽米曲霉素的檢測提供了借鑒方法，方便人們更加深入地研究米曲霉在不同培養(yǎng)條件下的毒素產生情況。

4 曲酸

曲酸是(kojic acid)是米曲霉的主要次生代謝物之一，分子式為C6HO4，它廣泛應用于食品、藥品和化妝品中。曲酸首先被報道為一種來自于蒸米上的米曲霉的結晶物質[30]。 Burdock G A等發(fā)現(xiàn)用谷物固態(tài)發(fā)酵的方法可以使曲酸高產，同時他們還發(fā)現(xiàn)曲酸的結構與己糖有著類似的相對簡單的代謝途徑。目前尚未報道由口服劑量引起的急性或亞慢性毒性，但如果注射曲酸，則可能發(fā)生驚厥[31]。由于它可以對酪氨酸酶的活性有一定抑制作用[32]，學術界對曲酸的安全性頗有爭議。在化妝品領域，曲酸因為有抗黑色素形成的作用而作為美白劑[33]。但Nakagawa M等對220位懷疑因使用化妝品而患有皮炎的女性患者進行了斑貼試驗，其中8名使用含至少1種曲酸產品的患者中在開始使用含曲酸的產品后1～12個月出現(xiàn)面部皮炎[34]，從而進一步證明曲酸可能會對皮膚產生不良反應。Zhang X還發(fā)現(xiàn)曲酸在一定程度上減少了葉綠素的損失以及水的蒸發(fā)，可作為一種保鮮劑。Wang 等還發(fā)現(xiàn)曲酸可以保護小鼠免受伽馬射線輻射的傷害，他們對30天生存率雄鼠的外周血參數(shù)進行變化評估測試，注射300 mg/kg體重的曲酸的實驗組與空白對照組的老鼠在一次致命劑量的照射下，注射曲酸的組所需致命劑量更高[35]。

曲酸的測定方法有很多種，Piantavini M S等利用紫外分光光度法來測定曲酸含量， Jiang Q等用高效液相色譜(HPLC)方法，利用電化學檢測器來測定食品或化妝品中曲酸的含量[36]，Lin Y H 等還利用毛細管電泳法對化妝品中的曲酸進行分析。此外，還有銅沉淀法、氯化鐵比色測定法等。

曲酸在病例毒性上尚未明確，但根據(jù)其會對皮膚造成損害的特點將其暫時歸為真菌毒素類，因其存在損害皮膚以及美白等影響，深入研究曲酸仍然具有重要意義。

5 結論與展望

米曲霉在我國以及整個亞洲地區(qū)的發(fā)酵食品中都有著非常廣泛的應用，其次生代謝產物真菌毒素的安全性更是得到人們的密切關注，本文對4種主要米曲霉真菌毒素的起源、病理毒性、檢測方法與防治進行了綜述，為米曲霉在發(fā)酵食品工業(yè)和生物工程產酶載體等領域的安全應用提供了參考思路。現(xiàn)階段對米曲霉產真菌毒素的條件和代謝機制尚未清晰，還需要深入的研究，指導食品用米曲霉的選育、發(fā)酵代謝調控和安全評估，以消除潛在真菌毒素的危害。