甌柑籽油中檸檬苦素類化合物的脫除工藝研究

曹雪丹 方修貴 王天玉 趙 凱

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州318026）

甌 柑(Citrus suavisima Hort.ex Tanaka)是蕓香科柑橘屬的一個(gè)栽培變種[1]，因其主要分布在我省浙南甌江沿岸而得名，在民國前史料《浪跡敘談》中既有“永嘉之柑，俗謂之甌柑……”的記述[2]。甌柑雖然存在皮厚而粗、蒂高多籽、可食率低等缺點(diǎn)，但是其果汁、果皮中都含有黃酮等具有抗氧化能力的生物活性成分，一般認(rèn)為甌柑果實(shí)中主要的苦味成分是新橙皮苷和柚皮苷[3]。除此之外，甌柑籽中也含有大量活性物質(zhì)如檸檬苦素類化合物等。但是目前國內(nèi)相關(guān)研究主要關(guān)注于甌柑果肉、果汁和果皮的黃酮類化合物分離、鑒定及其生物活性評價(jià)方面[4,5]，針對甌柑籽的研究較少，僅高文霞等[6]從甌柑籽中成功分離出檸檬苦素（C26H30O8），楊小鳳等[7]檢測出甌柑籽中含有的微量元素明顯高于果肉、果汁，如Ca約為3倍，F(xiàn)e約為8倍，Mg約為2.4倍，Mn約為1.8倍，Zn約為5.3倍。說明甌柑籽作為甌柑果肉、果汁加工產(chǎn)業(yè)的廢棄物仍具有重要的綜合利用價(jià)值，亟待開發(fā)。

柑橘籽中通常含有豐富的油脂（38.86%～42.59%）[8]，它們不同于用柑橘皮所制取的精油，其主要成分是脂肪酸，包括油酸、亞油酸及亞麻酸等大量不飽和脂肪酸，可考慮供人食用。但是，在制取甌柑籽油的過程中，具有抗癌、鎮(zhèn)痛抗炎和抗病毒等廣泛生物活性的檸檬苦素類化合物[9]也被保留了下來。這些物質(zhì)雖然具有一定的功能性，但其苦味閾值較低（1.0mg/L），且苦味是柚皮苷的20倍[10]，對甌柑籽油的口感影響極大，從而在一定程度上限制了甌柑籽油的推廣和開發(fā)。本試驗(yàn)采用乙醇加熱法從甌柑籽油中脫除檸檬苦素類化合物，以期為甌柑籽、油的加工和甌柑籽中檸檬苦素類化合物的利用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

甌柑籽，產(chǎn)自浙江省溫州市，由浙江森馬生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；檸檬苦素（≥98%），諾米林（≥98%），美國斯坦福（Stanford）分析化學(xué)公司；乙腈（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇等均為市售分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

1200 型高效液相色譜儀（安捷倫，美國）；NN-K566WS型微波爐（松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社，日本）；CZR108型榨油機(jī)（廣州萬彪通用設(shè)備有限公司）；JK-OB-5G型油浴鍋（上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甌柑籽油的制備及檸檬苦素類化合物的脫除方法

將甌柑籽經(jīng)分揀篩選去除異物和空籽后置于微波爐中高火加熱2min，趁熱投入螺旋式榨油機(jī)中進(jìn)行壓榨。收集甌柑籽油并在20±1℃下靜置過夜，取上清液于4℃冷藏，備用。

將一定量的柑橘籽油和乙醇溶液緩慢移入具塞試管中，在恒溫水浴鍋內(nèi)預(yù)熱至目標(biāo)溫度后立即振蕩數(shù)次進(jìn)行萃取脫苦，待萃取結(jié)束即用冷水降至常溫，靜置分層后量取萃取液并用高效液相色譜檢測檸檬苦素和諾米林含量。其中檸檬苦素類化合物的脫除量計(jì)算公式如下：

脫除量（μg/ml）=（C×V）/Vm。C：萃取液中檸檬苦素類化合物的濃度，以μg/ml計(jì)；V：萃取液的體積，以ml計(jì)；Vm：柑橘籽油樣品體積，以ml計(jì)。

1.2.2 單因素脫除試驗(yàn)

分別考察了不同料液比（1:1、1:3、1:5、1:7、1:9）、不同乙醇濃度（10%、30%、50%、70%、90%）和不同溫度（30、40、50、60、70℃）對柑橘籽油中檸檬苦素類化合物脫除量的影響。

1.2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，以料液比（A）、乙醇濃度（B）和溫度（C）為主要影響因素，設(shè)計(jì)L（934）正交優(yōu)化試驗(yàn)，各因素和水平見表1。

1.2.4 檸檬苦素及諾米林含量的測定

1.2.4.1液相色譜條件：色譜柱：Agilent C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈/水(40/60)；流速：1.000mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測波長：210nm；以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法峰面積定量。

1.2.4.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和線性相關(guān)性測定

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取檸檬苦素和諾米林標(biāo)準(zhǔn)品各0.0020g（精確到0.0001g），分別用乙腈配制成質(zhì)量濃度為200μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃下儲(chǔ)存，備用。

吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用乙腈逐步稀釋成質(zhì)量濃度為0.1，1，2，5，10，50μg/ml的一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2.4.1的條件下，分別進(jìn)樣10μL，平行測定3次，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度x(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積y(mAU·s)為縱坐標(biāo)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬苦素和諾米林的高效液相檢測及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

如圖1和2所示，檸檬苦素和諾米林在0～50μg/ml 的濃度下與峰面積之間具有較好的線性相關(guān)性，線性方程分別為y 7.235x+0.256和y=7.189x-0.424。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對檸檬苦素及諾米林脫除量的影響

乙醇濃度90%，溫度70℃下考察不同料液比（1:1、1:3、1:5、1:7和1:9）對檸檬苦素及諾米林脫除量的影響見圖3。

由圖3可知，檸檬苦素和諾米林從甌柑籽油中的脫除量隨料液比的增大呈先升后降的趨勢，且在料液比為1:5時(shí)脫除量最高。

2.2.2 乙醇濃度對檸檬苦素及諾米林脫除量的影響

料液比1:5，溫度70℃下，不同乙醇濃度（10%、30%、50%、70%和90%）對檸檬苦素及諾米林脫除量的影響見圖4。

圖1 標(biāo)品和樣品中檸檬苦素及諾米林的高效液相色譜

圖2 檸檬苦素及諾米林的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 料液比對檸檬苦素及諾米林脫除比例的影響

圖5 溫度對檸檬苦素及諾米林脫除量的影響

由圖4可知，檸檬苦素和諾米林從甌柑籽油中的脫除量隨乙醇濃度的增大呈先升后降的趨勢，且在乙醇濃度為70%時(shí)檸檬苦素的脫除量最高，而乙醇濃度為50%時(shí)諾米林的脫除量最高。同時(shí)，較低濃度的乙醇溶液對檸檬苦素的脫除作用有限，其脫除量明顯低于諾米林，這可能是檸檬苦素在不同濃度的乙醇溶液中溶解度差異較大所致。

2.2.3 溫度對檸檬苦素及諾米林脫除量的影響

料液比1:5、乙醇濃度50%時(shí)，不同溫度（30、40、50、60、70℃）對檸檬苦素及諾米林脫除量的影響見圖5。

由圖5可知，檸檬苦素和諾米林從甌柑籽油中的脫除量隨溫度的升高呈先緩慢增大后降低的趨勢，且在60℃時(shí)脫除量最高，隨后明顯下降。這可能是由檸檬苦素類化合物的熱穩(wěn)定特性造成，當(dāng)溫度達(dá)到一定的范圍后檸檬苦素和諾米林是否發(fā)生一定程度的降解尚待進(jìn)一步研究。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析

2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，選取料液比（A）、乙醇濃度（B）和溫度（C）進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2可知，采用乙醇加熱法脫除甌柑籽油中的檸檬苦素和諾米林的最佳組合為A3B2C2，即料液比1:7，乙醇濃度70%，溫度60℃為檸檬苦素類化合物最佳脫除條件，通過驗(yàn)證試驗(yàn)得出此條件下檸檬苦素從甌柑籽油中的脫除量為1101.01μg/ml，諾米林為600.06μg/ml。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用乙醇溶液加熱脫除甌柑籽油中的檸檬苦素類化合物，在料液比1:7，乙醇濃度70%，溫度為60℃的脫除條件下，檸檬苦素從甌柑籽油中的脫除量為1101.01μg/ml，諾米林為600.06μg/ml，經(jīng)過脫除工藝處理的甌柑籽油色澤更加透亮，苦味也得到明顯的改善，且脫除得到的含有檸檬苦素類化合物的乙醇溶液還可以通過進(jìn)一步濃縮、純化加以收集和利用。