沙門氏菌的特征及檢測方法研究進展

楊凌君， 葉 玲， 趙奕敏， 梁秀婷， 駱文俊， 王琤韋華*

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330013）

沙門氏菌（Salmonella）是一種常見的人畜共患病原菌，對人和動物的危害極大 （吳荔琴等，2017）。感染沙門氏菌后會加劇發(fā)病率或死亡率，降低動物的繁殖生產(chǎn)力。沙門氏菌容易污染食物，對食品安全構(gòu)成威脅 （Vivek等，2015；何曉芳，2013），因此有必要創(chuàng)建一種快速準確的沙門氏菌檢測方法。本文綜述了沙門氏菌的特征以及迅速檢測沙門氏菌的方法，以期為沙門氏菌的迅速檢測提供理論依據(jù)。

1 沙門氏菌概述

沙門氏菌屬作為腸桿菌科的一個大屬，是一種重要的革蘭氏陰性食源性致病菌，在自然界分布廣泛，種類繁多（朱奇等，2015）。食用被沙門氏菌污染的水和食物后，在宿主體內(nèi)可以引起腸道系統(tǒng)疾?。╓an 等，2017；Gong 等，2017）。 沙門氏菌屬根據(jù)細菌抗原分為四十二個群和兩千多種血清型，主要致病菌是A～E群的某些菌株（黃敏，2017）。通常情況下沙門氏菌使用量超過105cfu即可造成人類感染，而對于高度易感染人群15～20 cfu即可引起沙門氏菌感染 （Kokkinos等，2014）。蛋和肉類是沙門氏菌的主要載體。通過對沙門氏菌多方面的研究，可以提高禽蛋和肉類產(chǎn)品的食用安全指數(shù)。

2 沙門氏菌的特征

2.1 理化特征 沙門氏菌具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，一般沙門氏菌具有菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原和表面抗原 （莢膜或包膜抗原）三種抗原。竇雪如（2016）通過對沙門氏菌的質(zhì)量控制考核得出，沙門氏菌的三種抗原中，H抗原是蛋白質(zhì)，不耐熱，存在于鞭毛中，由鞭毛素組成，而鞭毛素中氨基酸不同的排列組合，決定著H抗原的特異性。胡麗君（2017）通過對147株腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和海德爾堡沙門氏菌進行全基因組測序，對比分析三種菌株攜帶的耐藥基因發(fā)現(xiàn)，不同血清型及不同來源的耐藥菌株攜帶的耐藥基因不同。申永秀等（2018）對來源于人和動物的261株沙門氏菌進行血清分型，對15種抗生素進行藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，多重耐藥性菌株較多，且人源與動物源菌株間耐藥特征存在明顯的相關(guān)性。

2.2 致病性 沙門氏菌屬有的對人類致病，有的只對動物致病，也有的對人和動物都致病。關(guān)紅等（2014）發(fā)現(xiàn)，從內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎病料中分離到的沙門氏菌能夠引起小鼠發(fā)病，且致病力較強。蔡雙雙等（2014）將分離鑒定得到的鴨源鼠傷寒沙門氏菌分為HP-2和HP-3株，用HP-2感染的小鼠全部死亡，有60%經(jīng)皮下注射途徑所感染的13日齡雛鴨死亡。隋明等（2018）通過從都江堰地區(qū)的53份冷鮮肉食品樣品中檢測出30株沙門氏菌分離株，其中24株沙門氏菌為致病性菌株，證實該地區(qū)冷鮮肉食品中沙門氏菌污染很嚴重，均具有很強的致病性。

2.3 耐藥性 由于抗生素的大量使用，近年來全世界面臨耐藥菌株加速出現(xiàn)等嚴重問題 （葛林，2018）。如沙門氏菌不僅耐藥率呈現(xiàn)出逐年上漲的趨勢，而且還產(chǎn)生了嚴重的多重耐藥性，很多經(jīng)常使用的抗生素藥效明顯降低乃至無效（刑艷萍等，2010）。廖成水等（2011）用雞肉中的98株沙門氏菌對22種藥物敏感性進行檢測發(fā)現(xiàn)，高達96.94%的沙門氏菌的抗藥力為三倍或者更高，而56.12%菌株的耐藥性高于七倍，最耐藥的菌株至多可以耐受18種抗生素。武運等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，17株腸炎沙門氏菌與11株哈瓦那沙門氏菌對經(jīng)常使用的抗生素藥物的耐藥性比較嚴重。林亞軍等（2018）選取瓊脂稀釋法對39株分散寵物源沙門氏菌進行敏感性試驗發(fā)現(xiàn)，39株寵物源沙門氏菌對至少六種抗菌藥都有抗藥性，高達97.4%的菌株對環(huán)丙沙星和阿莫西林具有抗藥性。鐘舒紅等（2018）利用K-B紙片法分散和測定沙門氏菌及他的血清型，并且使用24種抗菌藥物對隨機選取的80株分離株開始了敏感性試驗發(fā)現(xiàn)，100%沙門氏菌分離株具有多重耐藥性，而有78.75%的分離株具有高達10～16重耐藥。隨著沙門氏菌耐藥性增強，合理使用抗生素以及研發(fā)新的抗菌劑成為治療沙門氏菌相關(guān)疾病的關(guān)鍵。

2.4 受有機酸的抑制作用 有機酸以未分離分子的方式存在時，其可以穿透細胞壁，攪亂“pH敏感細菌”的一般生理，作用結(jié)果和抗生素十分相似（Thompson 等，1997）。 趙建芳等（2017）研究酢漿草的乙醇溶液和水溶液的提取物對4種細菌和1種真菌的抑制效果發(fā)現(xiàn)，酢漿草乙醇提取物對沙門氏菌和大腸桿菌有著很強的抑制效果。趙景鵬等（2018）通過對肉仔雞飼喂不同有機酸與精油組合發(fā)現(xiàn)，丁酸與其他精油組分對腸炎沙門氏菌具有協(xié)同抑制功效。基于沙門氏菌受到有機酸抑制作用這一現(xiàn)象，喂養(yǎng)禽類添加能較強抑制沙門氏菌的有機酸與其他物質(zhì)的混合物，可以從源頭上降低沙門氏菌對禽類以及禽蛋的感染，減少因食用被沙門氏菌感染的肉類以及蛋類而引起的食物中毒現(xiàn)象。

2.5 低溫控制生長 環(huán)境因素是影響沙門氏菌消長的重要因子之一，其中，溫度變化是影響沙門氏菌生長的主要因素 （Huang，2003）。趙格等（2016）發(fā)現(xiàn)，蛋殼完整的雞蛋受到致病菌的污染，可以在室溫下或冷藏環(huán)境中以清潔的方式貯存1個月，然而，在較高的溫度下，病原體會在第20天侵入卵。沈?qū)W懷等（2016）經(jīng)過在雞蛋殼表面人為的接種三種有差別的沙門氏菌，在不同的環(huán)境中儲藏，發(fā)現(xiàn)較低溫度和較低濕度條件能夠減少蛋殼表面沙門氏菌的生存時間。溫杰鋒等（2017）發(fā)現(xiàn)，在夏秋冬三季，卵殼和卵白的沙門氏菌感染率呈下降的趨勢，而且夏季感染率遠高于秋冬。

3 沙門氏菌快速檢測方法

3.1 免疫學(xué)方法

3.1.1 熒光免疫技術(shù)（IFT） 熒光法是利用Uio-66-NH2的熒光猝滅特征和核酸適配體的吸附性，創(chuàng)建了熒光生物傳感器用于沙門氏菌的檢測，當(dāng)改性的沙門氏菌和合適的適配體被原料吸附到表面時，沙門氏菌及其適配體會被特別束縛并從材料表面上移除，材料與熒光素之間的電子轉(zhuǎn)移過程被割斷，熒光素的熒光恢復(fù)（蔣曉華等，2018）。Wen等（2013）利用免疫磁球微球和免疫熒光微球結(jié)合沙門氏菌，可直接在熒光顯微鏡下檢測夾心免疫復(fù)合物，并用熒光光譜儀進行定量，該方法適用于105～107cfu/mL線性范圍內(nèi)，最低檢測限值為10 cfu/mL。Wang等（2014）用高熒光強度和高水溶性的CdTe量子點當(dāng)成熒光標識物，創(chuàng)建了檢測蛋殼上的沙門氏菌免疫光的高度特異性方法，發(fā)現(xiàn)細菌液體濃度與熒光強度呈現(xiàn)出良好線性關(guān)系的沙門氏菌濃度為3×102～3×107cfu/mL。Pandey等（2014）應(yīng)用了一個新的基于Vi莢膜多糖檢測的夾心熒光免疫分析法，使用陽離子受體分子多粘菌素B作為黏結(jié)劑而抗Vi抗體作為捕集劑，以堿性磷酸鹽標記二抗，對硝基苯酚磷酸鹽為顯示底物，特異性檢測傷寒沙門氏菌，檢測限為10 cfu/mL。熒光免疫技術(shù)在檢測過程當(dāng)中比傳統(tǒng)方法更快、更簡單、更靈敏。然而熒光免疫技術(shù)的結(jié)果鑒定存在主觀性和非特異性染色的問題，并且操作環(huán)節(jié)也比較復(fù)雜。

3.1.2 酶聯(lián)免疫吸附測定方法（ELISA） 酶聯(lián)免疫吸附測定方法是利用在抗原和抗體之間產(chǎn)生的固相化和酶標記。Kumar等（2008）選用酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測傷寒沙門氏菌。Bang等（2012）創(chuàng)立間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定方法用于檢測鼠傷寒沙門氏菌。張帥等（2016）創(chuàng)建雙抗夾心酶聯(lián)免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)是吸附多抗體當(dāng)作96孔酶標記的抗體，并利用辣根過氧化物酶標記單抗體，檢查到模仿被污染的肉類中沙門氏菌的上限是800 cfu/g，與其余的血清類沙門氏菌沒有交叉反應(yīng)，特異性較好。李珊珊等（2018）創(chuàng)建C2和C3亞群沙門氏菌的酶聯(lián)免疫吸附測定方法，結(jié)果表明對沙門氏菌C2亞群的兩種菌株以及C3亞群的一種菌株的最低檢出值都能夠到達105cfu/mL，且用于鑒定特異性的其他沙門氏菌和非沙門氏菌在濃度為108cfu/mL時無交叉反應(yīng)。ELISA方法具有使用方便、檢測迅速、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點。然而該方法檢出抗體的持續(xù)時間較長，更符合抗體消長規(guī)律。

3.2 分子生物學(xué)方法

3.2.1 聚合酶鏈式反應(yīng)方法（PCR） PCR方法是Kary Mullis在1985年建立的一種能夠在體外進行基因擴增的方法 ，該方法能夠快速在體外進行擴增目標基因的DNA片段，達到檢測所需的檢測量（張萍，2015）。 Jacobsen 等（2007）研究表明，熒光定量PCR不能有效區(qū)分死菌和活菌，所以熒光定量PCR方法不適用于檢測加熱致死的菌體樣品。Bakthavathsalam等（2013）利用IMS實時PCR檢測牛奶與檸檬汁中的沙門氏菌，3～4 h內(nèi)可檢測103cfu/mL的沙門氏菌。Zheng等（2014）創(chuàng)建的PCR-IMS技術(shù)是用熒光定量PCR和免疫磁珠分離共同結(jié)合而成，分別經(jīng)過7 h和14 h的增菌后可檢測鴨翅中101～100cfu/25g正常的沙門氏菌和熱受損的沙門氏菌。王青龍等 （2018）根據(jù)GenBank公布的亞利桑那沙門氏菌和其他沙門氏菌gud D基因序列，研究了Taqman探針和引物對沙門氏菌進行實時熒光PCR特異性試驗，發(fā)現(xiàn)試驗檢測結(jié)果與傳統(tǒng)相同，擁有檢測周期短、操作簡單等優(yōu)點，其中靈敏度試驗可以達到1～10 cfu/mL。熒光定量PCR方法不適合檢測熱誘導(dǎo)細菌樣品，可是結(jié)合熒光定量PCR和免疫磁珠分離技術(shù)可以檢測出熱損傷的沙門氏菌。

3.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) （LAMP） LAMP技術(shù)是一種新式的核酸擴增技術(shù)，其在60～65℃的恒溫前提下將目標序列擴大到109水平（王羽，2010；Nomomi等，2000）。 LAMP 技術(shù)與 PCR 擴增技術(shù)相比，它的靈敏度、檢測限度和特異性均能滿足檢測目標，而且LAMP技術(shù)優(yōu)于PCR技術(shù)（Tomita 等，2008）。 Ravan 等（2012）利用 prt基因當(dāng)作沙門氏菌D血清群的靶基因，對5個沙門氏菌D群和4個其余的沙門氏菌血清群進行了特異性檢出。Chayapa等（2012）創(chuàng)立了腸炎沙門氏菌的RT-LAMP檢測技術(shù)，通過濃縮培育16 h后，純細菌的檢測范圍包括使用DNA酶處理及沒有使用DNA酶處理的分別為100cfu/mL和101cfu/mL。Zhuang等（2014）利用bcf D基因建立的LAMP檢測限為5×100，反應(yīng)時間為25 min。王瑾等（2016）根據(jù)沙門氏菌的inv A基因序列研制了一種利用米氏綠熒光染料檢測沙門氏菌的新的LAMP技術(shù)，發(fā)現(xiàn)檢測總過程只需45 min，靈敏度達到6 cfu/管，而且經(jīng)過模仿人為污染的25 g沙門氏菌的雞肉樣品，在37℃完成了用來檢測樣品中的實時熒光定量環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的DNA模板，發(fā)現(xiàn)靈敏度到達450 cfu/g，一共大約耗時7 h。LAMP技術(shù)擁有特異性高、敏感性高、簡單、方便和成本低的特征，但在檢測過程中容易污染，造成假陽性。

3.2.3 探針方法 檢測沙門氏菌探針方法的原理是將納米粒子與數(shù)百個量子點連接起來，制備用于信號放大的顯示探針，并且使用親和性和生物素的特異性結(jié)合原理，制備能捕捉到沙門氏菌DNA熒光強度的探針。Cremonesi等（2014）利用Taq Man熒光探針建立實時PCR對沙門氏菌進行檢測，靈敏度達1 pg基因組DNA，相當(dāng)于1 cfu/mL。謝同彬等（2017）通過制備CdTe量子點-納米金顯示探針與磁性納米粒子捕獲探針結(jié)合成的復(fù)合納米探針對樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌為10～1000 fmol/L時，其DNA濃度與熒光強度展現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，檢出上限為8 fmol/L，最低限值為4 fmol/L。探針方法具有敏感、特異、簡便、快速的特點。

3.2.4 LAMP微流控芯片技術(shù) LAMP微流控芯片技術(shù)是用于沙門氏菌等食源性病原體的一種將LAMP技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)。微流控技術(shù)經(jīng)過化學(xué)分析設(shè)備的小型化和集成，最大限度地將分析實驗室的作用集成到芯片中（Jokerst等，2012）。LAMP微流控芯片技術(shù)集成了LAMP反應(yīng)系統(tǒng)在芯片上。鞠鶴鵬等（2018）通過設(shè)計LAMP引物與微流控芯片制作成用來檢測三種致病菌的LAMP微流控芯片，其中這三種致病菌分別為沙門氏菌、大腸桿菌O157和金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)制作好的LAMP微流控芯片擁有良好的特異性，三種致病菌的檢測靈敏度都可以到達100 cfu/mL，可以用在食源性致病菌的迅速現(xiàn)場檢測方面。LAMP微流控芯片技術(shù)具有體積小、分析速度快、樣品和試劑用量少等優(yōu)點，然而試驗結(jié)果中易出現(xiàn)假陽性，降低了試驗結(jié)果的準確性。

4 結(jié)語

目前，已經(jīng)有很多快速檢測沙門氏菌的技術(shù)，但在實踐中，大多數(shù)技術(shù)都存在著操作環(huán)節(jié)復(fù)雜、耗時多、靈敏度低等部分缺點。而探針方法卻具有敏感、特異、簡便、快速的特點。由于沙門氏菌引起的食源性疾病較為嚴重，其檢驗技術(shù)始終受到人們的重視，因此有必要研究出一種更簡便、靈敏度更高、耗時更短、花費更少的檢測方法，預(yù)防沙門氏菌的污染。